| 研究概要 |
粗面小胞体で合成された液胞タンパク質は,液胞輸送シグナルを持ち,輸送レセプターによって液胞まで選択的に運ばれる.本研究では,申請者らが見出したカボチャ輸送レセプターPV72を解析することにより,高等植物における液胞タンパク質の輸送機構の解明を目指した.今年度は,主に以下の点について解析を加えたので報告する.
輸送レセプターPV72とリガンドとの相互作用の解析
昨年度の研究で,形質転換シロイヌナズナを用いてリガンド結合活性のある改変レセプター分子を発現させる系を確立した.しかしながら発現量が少ないため,今年度はより大量発現を目指して,バキュロウイルスー昆虫細胞系での発現を試みた.PV72のルーメンドメインのC末端にヒスチジンタグを付けたコンストラクトをウイルスに組み込み昆虫細胞に感染させた.その結果,感染後1日目から発現産物(rPV72)が検出され,リガンド結合活性が確認された.rPV72のN末端を調べたところ植物細胞由来のPV72のそれと同一であった.rPV72をアフィニテイー精製後,生体物質相互作用解析装置BIACORE2000を用いて結合様式の解析を行った.その結果,2S-Iペプチド(カボチャ2Sアルブミン由来)に対する解離定数は60nMと強いことが判明した.また,レセプターとリガンドペプチドの結合がカルシウム依存的であり,中性溶液中でもEDTA存在下では解離することが確認された.レセプターとリガンドペプチドが酸性条件下で解離することは既に知られているが,今回の結果より,酸性化がカルシウムの解離を引き起こし,その結果リガンドが離れるスキームが示唆された.
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