遺伝子組換え微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の合成

• 研究課題/領域番号: 10750640
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 高分子合成
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 福居 俊昭 京都大学, 大学院・工学研究科, 助手 (80271542)
• 研究期間 (年度): 1998 – 1999
• 研究課題ステータス: 完了 (1999年度)
• 配分額: 900千円 (直接経費: 900千円); 1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: 生分解性プラスチック / ポリヒドロキシアルカン酸 / PHA / P(3HB) / Aeromonas caviae / Ralstonia eutropha / PHAシンターゼ / ポリエステル重合酵素

研究概要

微生物が合成し蓄積するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は生分解性という特徴を有する熱可塑性高分子であることから、環境に負荷を与えない無公害プラスチックとしての応用が期待されている。本研究では遺伝子工学的手法により、油脂や廃棄バイオマス(廃糖蜜や酒造廃液など)といった安価な炭素源から良好に増殖し、優れた物性のPHAを効率よく生合成・蓄積する微生物の育種を目指す。
土壌より単離したAeromonas caviae FA440株は中長鎖脂肪酸や油脂を炭素源として3-ヒドロキシブタン酸(3HB)と3-ヒドロキシヘキサン酸(3HHx)からなる共重合ポリエステル、P(3HB-co-3HHx) (3HHx分率10-25mol%)を合成・蓄積する。平成11年度は、これまでにクローニングしたA.caviae由来ポリエステル合成酵素(PHAシンターゼ)遺伝子を増幅した組換えA.caviae を作製し、そのポリエステル合成能について検討した。その結果、PHAシンターゼ遺伝子(phaC_<AC>)とその上流に位置するORF1を含むDNA断片を導入した組換え株は、野生株より高い3HHx分率(50-60mol%)からなるP(3HB-co-3HHx)を蓄積することを見いだした。ウエスタン解析や酵素活性測定の結果から、高3HHx分率からなる共重合ポリエステルを蓄積する株ではPHAシンターゼが高発現していることが示され、高い重合活性がポリエステル組成決定に関与している可能性が示唆された。
また、A.caviaeからnative PHAグラニュールを密度勾配遠心により単離してグラニュール結合タンパクの解析を行ったところ、A.caviae由来グラニュールには63kDa、14kDaの2種のタンパクが主に結合していた。63kDa結合タンパクはウエスタン解析からPHAシンターゼと同定された。また14kDa結合タンパクのN-末端アミノ酸配列から、PHAシンターゼ遺伝子上流に位置するORF1によりコードされるタンパクであることが示された。このことから、A.caviae由来PHA合成系遺伝子は14kDaグラニュール結合タンパク-PHAシンターゼ-(R)-特異的エノイル-CoAヒドラターゼの順でクラスターを構成していることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] T.Fukui et al.: "Co-expression of polyhydroxyalkanoate synthase and R-enoyl-CoA hydratase genes of Aeromonas caviae establishes copolyester biosynthesis pathway in Escherichia coli"FEMS Microbiol.Lett.. 170. 69-75 (1999)
• [文献書誌] T.Kichise et al.: "Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates(PHA) by recombinant Ralstonia eutropha and effects of PHA synthase activity on in vivo PHA biosynthesis"Int.J.Biol.Macromol.. 25. 69-77 (1999)
• [文献書誌] K.Sudesh et al.: "Improved production of poly(4-hydroxybutyrate) by Comamonas acidovorans and its freeze-fracture morphology"Int.J.Biol.Macromol.. 25. 79-85 (1999)
• [文献書誌] K.Taguchi et al.: "Co-expression of 3-ketoacyl-ACP reductase and polyhydroxyalkanoate synthase genes induces PHA production in Escherichia coli HB101 strain"FEMS Microbiol.Lett.. 176. 183-190 (1999)
• [文献書誌] K.Taguchi et al.: "Over-expression of 3-ketoacyl-ACP synthase III or malonyl-CoA-ACP transacylase gene induces monomer supply for polyhydroxybutyrate production in Escherichia coli HB101"Biotechnol.Lett.. 21. 579-584 (1999)
• [文献書誌] T.Fukui et al.: "Expression and chaeacterization of (R)-specific enoyl-coenzyme A hydratase involved in polyhydroxyalkanoate biosynthesis by Aeromonas caviae" J.Bacteriol.180. 667-673 (1998)
• [文献書誌] T.Fukui et al.: "Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain" Appl.Microbiol.Biotechnol.49. 333-336 (1998)
• [文献書誌] T.Fukui et al.: "Morphological and ^<13>C-nuclear magnetic resonanoe studies for polyhydroxyalkanoate biosynthesis in Pseudomonas sp.61-3" FEMS Microbiol.Lett.164. 219-225 (1998)
• [文献書誌] H.Matsusaki et al.: "Cloning and molecular analysis of the poly(3-hydroxybutyrate)and the poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoates)biosynthesis genes in Pseuadomonas sp,61-3" J.Bacteriol.180. 6459-6467 (1998)
• [文献書誌] T.Fukui et al.: "Co-expression of polyhydroxyalkanoate aynthase and (R)-enoyl-CoA hydratase genes of Aeromonas caviae establishes copolyester biosynthesis path way in Escherichia coli" FEMS Microbiol.Lett.170. 69-75 (1999)