| 研究課題/領域番号 |
10770134
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
ウイルス学
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1999年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1998年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | アデノ随伴ウイルス / Rep蛋白質 / 部位特異的組込み / アラニンスキャンニング変異導入 |
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| 研究概要 |
昨年度に実施した、アデノ随伴ウイルス(AAV)のRep蛋白質の変異導入による解析により、細胞毒性が減弱しているEK57AA、RD61AA、R122A、R185A、E201Aの計5クローンを同定した。これら5クローンが本当に野生型Rep蛋白質と同程度のAAVS1特異的組込み活性を保持しているか詳細に調べるため、AAVのinverted terminal repeat(ITR)配列ではさんだNeo遺伝子プラミスドと変異Rep蛋白質発現プラミスドを293細胞にトランスフェクションし、G418存在下で培養を行った。そこから得られたクローンをランダムに拾いそれらのサザン解析を行い、Neo遺伝子がAAVS1領域に組込まれている頻度を検討した。野生型Repを用いた場合は60%(12/20)のクローンでAAVS1特異的組込みが認められ、E201Aを用いた場合、89%(25/28)のクローンでAAVS1特異的組込みが確認できた。一方、その他のEK57AA、RD61AA、R122A、R185Aを用いた場合はAAVS1特異的組込みを示したクローンの頻度は20%以下であった。以上のことは、E201Aが野生型Repと同程度、もしくは、より高い部位特異的活性を保持していることを示しており、細胞毒性が減弱していることと考え合わせ、染色体の特定の部位に任意の外来性遺伝子を導入するテクノロジーにより適している可能性があると考えられる。
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