• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 前のページに戻る

一分子転写運動の抑制機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 10780367
研究種目

奨励研究(A)

配分区分補助金
研究分野 構造生物化学
研究機関京都大学

研究代表者

加畑 博幸  京都大学, 大学院・工学研究科, 助手 (70293884)

研究期間 (年度) 1998 – 1999
研究課題ステータス 完了 (1999年度)
配分額 *注記
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1998年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
キーワードT7RNAポリメラーゼ / 転写 / 伸長固定化 / DNA / リプレッサー / 蛍光 / 1分子ダイナミクス / RNAポリメラーゼ / 伸長固定化DNA / スライディング
研究概要

T7RNAポリメラーゼがDNA鎖に沿ってRNA鎖を合成するときの転写運動を同定するため、T7RNAポリメラーゼ分子を蛍光顕微鏡下で可視化した。可視化には、ポリメラーゼ1分子に100分子の蛍光色素が導入される必要がある。そこで、ストレプトアビジン蛋白質を蛍光色素TRITCで修飾して蛍光タグとし、これをあらかじめポリメラーゼに導入したビオチン残基と結合させることでポリメラーゼ分子を蛍光修飾する方法を開発した。この蛍光タグは、硫安分画法を用いることで未修飾のTRITC分子や可視化に不充分な数のTRITCで修飾されたアビジンとは別の画分に精製され、タグ1分子にTRITCが100分子以上結合していることを分光法により確認した。この蛍光タグを修飾したT7RNAポリメラーゼの溶液をスライドグラスに滴下して観察したところ、溶液中で明るい光点として検出された。
ポリメラーゼの運動がDNA上で生じていること証明するためには、DNAを蛍光色素Yo-Proにより可視化しなければならない。そこで、Yo-Proがポリメラーゼの転写活性に与える影響を調べるため、Yo-Pro存在下および非存在下でのRNA合成産物の量をオートラジオグラフィーにより比較した。大過剰のYo-Pro存在下では非存在下にくらべ転写産物の量が二分の一に減少したが、DNAの検出に十分な濃度のYo-Pro存在下では転写産物の量に変化は見られなかった。このことから、ポリメラーゼとDNAの2重染色を行なった状態での転写運動の顕微鏡観察が可能であることを見出した。現在までに、転写運動の初期段階であるバイナリーコンプレックスの形成の可視化に成功している。

報告書

(2件)
  • 1999 実績報告書
  • 1998 実績報告書
  • 研究成果

    (1件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (1件)

  • [文献書誌] Yamamoto,T.,Kurosawa,O.,Kabata,H.,Shimamoto,N.,Washizu,M.: "Molecalar Surgery of DNA based on electrostatic maniplateion"IEEE Trans.IA. (in press).

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書

URL: 

公開日: 1998-04-01   更新日: 2016-04-21  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi