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がん原物質に対して高感受性を示すヒトプロト型c-Ha-ras遺伝子を導入したrasH2マウスに形成された腫瘍について、COH(Comparative genomic hybridization)法を用いてゲノム異常領域のスクリーニング方法を確立し、rasH2マウスに形成された腫瘍のゲノム異常領域を探索することを目的として本研究を行った。
マウスの牌細胞培養および染色体標本作製の条件を検討した。牌細胞回収後、ConA、LPS、PHAを組み合わせて培養し、mitoindexの高いサンプルを得ることができた。また、低張処理の時間や温度を検討して、良好な染色体標本を作製した。
腫瘍組織および正常組織由来のDNAの標識においては、CGH法に適しているサイズになる条件を決定した。また、良好なCGH解析を行えるようにするため、腫瘍組織および正常組織由来DNAプローブを標識した蛍光物質の特徴を考慮して、各々の濃度を決定した。
マウス染色体では各染色体の大きさが均一で同定が困難なので、各染色体に特異的なBAC cloneを腫瘍組織および正常組織由来DNAプローブと同時にハイブリし、確実な染色体同定を行なえる方法を確立した。まず、反復配列の多いセントロメアはCGH解析に適さないので、各染色体のセントロメアに特異的なBACdoneをスクリーニングした。BAC cloneスクリーニングは、セントロメアにマップされているマイクロサテライトマーカーを用いてPCRを行い、BAC libraryからそのマーカーのみ含まれているBAC cloneをスクリーニングし、そのDNAを抽出して染色体同定用のプローブとした。各々のプロープについてFISHを行い、確実にセントロメアにシグナルが観察されたことを確認した。腫瘍組織由来DNAはSpectrumRedで、正常組織由来DNAはSpectrum Greenで標識し、BAC cloneはCGH解析に支障のないよう、波長の異なる蛍光色素Cy5で標識した。
rasH2マウスにMNUを投与して形成された前胃乳頭腫5検体についてCGH解析したところ、ゲノム異常は認められなかった。同様にUrethaneにより形成された肺腫瘍8検体でもゲノム異常は認められなかった。今後、rasH2マウスに形成された各種腫瘍において本研究で確立したCGH法によりゲノム異常領域の検索を行うことが重要である。
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