ナノ技術を応用した新規遺伝子導入法の開発

• 研究課題/領域番号: 10J00803
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 外科系歯学
• 研究機関: 九州歯科大学 (2011); 京都大学 (2010)
• 研究代表者: 大澤 賢次 九州歯科大学, 歯学部, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2010 – 2011
• 研究課題ステータス: 完了 (2011年度)
• 配分額: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2011年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2010年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
• キーワード: 骨 / 遺伝子導入 / 再生医学 / プラスミドベクター / 骨形成因子(BMP) / MEMS

研究概要

ナノ技術を応用した新規遺伝子導入法の探索として、先端の大きさが10μmの針を用いて細胞膜を穿孔させ、その孔を通じて細胞外に存在する遺伝子(プラスミドベクター)を細胞内へ導入するという手法を用いて、骨形成因子(BMP-2)遺伝子導入による間葉系未分化細胞から骨芽細胞への分化誘導を目的に実験を行った。まず、マウス間葉系未分化細胞株C3H10T1/2に対して、今回の手法が有効であるかをLacZ遺伝子発現ベクターを導入し、X-gal染色を行って確認したところ、陽性細胞が確認できた。次に、添加するLacZ発現ベクター濃度を変化させ、それぞれの細胞培養ディッシュ上の100個の細胞に遺伝子導入操作を行い、導入効率の高い条件について検討を行ったところ、ベクターの添加濃度が0.3mg/mlで最も効率よく遺伝子導入され、100個の遺伝子導入操作を行った細胞に対して、染色陽性を示した細胞が最大で100個みられた。続いて、ヒトBMP-2遺伝子発現プラスミドベクターを用いて、同様に遺伝子導入を行った。まず、遺伝子導入後7日目の細胞を回収し、RT-PCRを行ったところ、導入遺伝子であるヒトBMP-2のmRNAの発現が確認された。つぎに、遺伝子導入後7日目の細胞に骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ染色を行ったところ、染色陽性が確認された。さらに遺伝子導入後21日目の細胞を固定しVon Kossa染色を行ったところ、染色陽性が確認できカルシウムの沈着が確認できた。この結果から、極微細針を用いた遺伝子導入法は、これまで用いられてきたリポフェクションなどの試薬を用いた方法や、エレクトロポレーションなどの物理的エネルギーを用いる方法と比較して、高い導入効率を示し、この遺伝子導入法を応用して未分化細胞から骨芽細胞への分化誘導にも用いることが可能であることを示した。

研究成果

• [雑誌論文] Accumulation of p 100, a precursor of NF-kB2, enhances osteoblastic differentiation in vitro and bone formation in vivo in aly/aly mice (2012)
  • 著者名/発表者名: Seo Y, Fukushima H, Maruyama T, Kuroishi KN, Osawa K, Nagano K, Aoki K, Weih F, Doi T, Zhang M, Ohya K, Katagiri T, Hosokawa R, Jimi E
  • 雑誌名: Molecular Endocrinology 巻: 26 ページ: 414-422
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selective inhibition of NF-kB suppresses bone invasion by oral squamous cell carcinoma in vivo (2012)
  • 著者名/発表者名: Furuta H, Osawa K, Shin M, Ishikawa A, Matsuo K, Khan M, Aoki K, Ohya K, Okamoto M, Tominaga K, Takahashi T, Nakanishi O, Jimi E
  • 雑誌名: International Journal of Cancer 巻: (in press) 号: 5
  • DOI: 10.1002/ijc.27435
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Current and Future Therapies of Bone Regeneration to Repair Bone Defects (2012)
  • 著者名/発表者名: Jimi E, Hirata S, Osawa K, Terashita M, Kitamura C, Fukushima H
  • 雑誌名: International Journal of Dentistry 巻: 148261 ページ: 1-7
  • DOI: 10.1155/2012/148261
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder (2011)
  • 著者名/発表者名: Koyama N, Okubo Y, Nakao K, Osawa K, Fujimura K, Bessho K
  • 雑誌名: Life Science 巻: 89 ページ: 741-747
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Current and Future Therapies of Bone Regeneration to Repair Bone Defects (2011)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto I, Togo Y, Osawa K, S Yasuda
  • 雑誌名: Asian Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 巻: 23 ページ: 87-91
  • 査読あり
• [雑誌論文] Osteoinduction by repeat plasmid injection of human bone morphogenetic protein-2. (2010)
  • 著者名/発表者名: K Osawa, Y Okubo, K Nakao, N Koyama, K Bessho
  • 雑誌名: The Journal of Gene Medicine 巻: 12 ページ: 937-944
  • 査読あり
• [雑誌論文] Experimental study of osteoinduction using a new material as a carrier for bone morphogenetic protein-2. (2010)
  • 著者名/発表者名: N Koyama, Y Okubo, K Nakao, K Bessho
  • 雑誌名: Ritish Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 巻: in press
  • 査読あり
• [学会発表] 低侵襲なBMP-2遺伝子導入法による骨形成に関する基礎的検討 (2011)
  • 著者名/発表者名: 大澤賢次, 自見英治郎
  • 学会等名: 第53回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 長良川国際会議場
  • 年月日: 2011-10-01
• [学会発表] C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の顎顔面骨における影響及び臨床応用の可能性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 中尾一祐, 大久保康則, 八十田明宏, 小山典昭, 大澤賢次, 藤井寿人, 近藤絵里, 金本巨哲, 三浦晶子, 中尾一和, 別所和久
  • 学会等名: 第29回日本骨代謝学会学術集会
  • 発表場所: 大阪国際会議場
  • 年月日: 2011-07-28
• [学会発表] アドレノメデュリンはcAMPシグナルを介して破骨細胞形成を抑制する (2011)
  • 著者名/発表者名: 中尾一祐, 三浦晶子, 小山典昭, 大澤賢次, 上田依利子, 山下唯, 近藤絵里, 藤井寿人, 金本巨哲, 八十田明宏, 荒井宏司, 別所和久, 中尾一和
  • 学会等名: 第29回日本骨代謝学会学術集会
  • 発表場所: 大阪国際会議場
  • 年月日: 2011-07-28
• [学会発表] Osteoinduction by Ultrasound-mediated Gene Transfer of Bone Morphogenetic Protein-2. (2011)
  • 著者名/発表者名: K Osawa, Y Okubo, K Nakao, N Koyama, K Bessho
  • 学会等名: 89^<th> General Session and Exibition of the International Association of Dental Research
  • 発表場所: San Diego, CA USA
  • 年月日: 2011-03-18
• [図書] Bone Morphogenetic Proteins : New Research (2012)
  • 著者名/発表者名: Osawa K, Okubo Y, Nakao K, Koyama N, Bessho K
  • 総ページ数: 21
  • 出版者: Osteoinduction by Low-invasive Approach Using Human Bone Morphogenetic Protein-2 Encoding Plasmid DNA
• [図書] Targets in Gene Therapy (2011)
  • 著者名/発表者名: Osawa K, Okubo Y, Nakao K, Koyama N, Bessho K
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: Feasibility of BMP-2 Gene Therapy Using an Ultra-Fine Needle