アポトーシス関連因子ALG－2の機能に関する構造生物学的解析

• 研究課題/領域番号: 10J06388
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 犬塚 達俊 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 特別研究員DC1
• 研究期間 (年度): 2010 – 2012
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 2012年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2011年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2010年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
• キーワード: ALG-2 / カルシウム結合タンパク質 / 立体構造 / モチーフ / エンドソーム / 分泌 / エクソソーム / 脂質付加 / PLSCR3 / exosome / palmitoylation / crystal structu / apoptosis / crystal structure / Sec31A / COP II / cell death

研究概要

ALG-2がカルシウム依存的に結合するPLSCR3のII型モチーフは、ALIXなどのI型モチーフの結合部位とは異なる部位に結合することが変異体を用いた解析より推測されていた。既知のALG-2の立体構造をタンパク質表面上の疎水ポケットを予測するコンピュータープログラムを用いて解析したところ、新たなポケットが見出され、PLSCR3のII型モチーフの仮想ペプチド構造とのドッキングシミュレーションによって、このポケットにII型モチーフが結合する可能性が示唆された。結合に関与する可能性のあるアミノ酸を別の残基に置換したALG-2変異体を調製し、PLSCR3との結合を解析したところ、予想されたように結合能の低下が観察され、シミュレーション結果が正しいことが強く示唆された。
PLSCR3はシグナルペプチドをもたないが、細胞外に分泌されることをすでに見出していたが、その形態をより詳細に解析した。分泌されたPLSCR3は10万g沈殿画分に回収され、プロテアーゼ抵抗性、界面活性化剤存在下でのプロテアーゼ感受性、10万g沈殿画分のショ糖密度勾配超遠心解析より算出される密度より、PLSCR3はエクソソームに存在することが判明した。PLSCR3にはシグナルペプチドが存在しないため、小胞体・ゴルジ体を経ずに別のメカニズムによって分泌されることが想定された。PLSCR3の細胞内局在解析により、PLSCR3は多胞性エンドソームを経由して細胞外に放出されることが示唆された。また、PLSCR3のパルミチン酸付加部位の変異体は分泌されず核に移行することも分かった。ALG-2結合部位の欠損変異体も分泌されることから、ALG-2は分泌に対して直接には関与していないと思われる。

研究成果

• [雑誌論文] ALG-2-interacting Tubby-like protein superfamily member PLSCR3 is secreted by exosomal pathway and taken up by recipient cultured cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inuzuka T, Inokawa A. Chen C, Kizu K, Narita H, Shibata H, Maki M.
  • 雑誌名: Bioscience Reports 巻: 33 号: 2
  • DOI: 10.1042/bsr20120123
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prediction of a New Ligand-Binding Site for Type 2 Motif based on the Crystal Structure of ALG-2 by Dry and Wet Approaches. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takahashi T, Suzuki H, Inuzuka T, Shibata H, Maki M.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Science 巻: 13 号: 6 ページ: 7532-7549
  • DOI: 10.3390/ijms13067532
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular basis for defect in Alix-binding by alternatively spliced isoform of ALG-2 (ALG-2DeltaGF122) and structural roles of F122 in target recognition. (2010)
  • 著者名/発表者名: Inuzuka T, Suzuki H, Kawasaki M, Shibata H, Wakatsuki S, Maki M.
  • 雑誌名: BMC Struct Biol 巻: 10 ページ: 25-25
  • 査読あり
• [雑誌論文] The ALG-2 binding site in Sec31A influences the retention kinetics of Sec31A at the endoplasmic reticulum exit sites as revealed by live-cell time-lapse imaging. (2010)
  • 著者名/発表者名: Shibata H, Inuzuka T, Yoshida H, Sugiura H, Wada I, Maki M.
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 巻: 74(9) ページ: 1819-1826
  • 査読あり
• [学会発表] Phospholipid scramblase 3 のエキソソーム経路による細胞外分泌に関する研究 (2012)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊、猪川亮、木津久美子、柴田秀樹、成田宏史、牧正敏
  • 学会等名: 第165回日本農芸化学会中部支部例会
  • 発表場所: 名古屋大学
  • 年月日: 2012-10-27
• [学会発表] How can ALG-2 recognize two different binding motifs and function as a Ca^<2+>-dependent adaptor? (2012)
  • 著者名/発表者名: Takahashi T, Suzuki H, Inuzuka T, Ito M, Shibata H and Maki M
  • 学会等名: 欧州カルシウム学会2012
  • 発表場所: Hotel Dieu, Toulouse フランス
• [学会発表] Translocation of phospholipid scramblase 3 into nucleus by palmitoylation inhibition (2012)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊、猪川亮、木津久美子、柴田秀樹、成田宏史、牧正敏
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会
  • 発表場所: 福岡国際会議場
• [学会発表] パルミトイル化によるPhospholipid scramblase 3の局在差異 (2011)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊
  • 学会等名: 第34回日本分子生物学会
  • 発表場所: 神奈川県・パシフィコ横浜
  • 年月日: 2011-12-15
• [学会発表] Phospholipid scramblase 3のパルミトイル化およびセラミド依存的な細胞外分泌 (2011)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊
  • 学会等名: 農芸化学会関西・中部支部合同大会
  • 発表場所: 京都府・京都大学
  • 年月日: 2011-10-02
• [学会発表] Phospholipid scramblase3のエキソソーム経路による分泌 (2011)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊
  • 学会等名: 第84回日本生化学会
  • 発表場所: 京都府・国立京都国際会館
  • 年月日: 2011-09-23
• [学会発表] PLSCR3の細胞内局在および細胞外分泌 (2011)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊
  • 学会等名: 日本農芸化学会2011年度大会
  • 発表場所: 要旨集
  • 年月日: 2011-03-05
• [学会発表] ミトコンドリア局在型リン脂質scramblase 3の細胞内局在に対するパルミトイル化の影響 (2010)
  • 著者名/発表者名: 犬塚達俊
  • 学会等名: 第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド、兵庫県
  • 年月日: 2010-12-08