| 研究概要 |
酵母細胞表層への標的分子を提示するための基礎研究を行った。
1)S.pombe細胞壁からα-1,3、β-1,3-、β-1,6-グルカンを精製し、NMRを用いて解析した。β-1,6-グルカンは高頻度にβ-1,3分岐していた。得られた抗体の免疫電子顕微鏡像では、α-1,3-グルカンはS.pombeの細胞壁に局在した。
2)β-1,6-、β-1,3-、およびα-1,3-グルカンのクロスリンクする機構を免疫電子顕微鏡法で解明するため、加圧凍結細胞の固定条件を検討し、S.pombeの固定法を確立した。
3) 2)の条件で3種類のβ-グルカンの局在を解析した結果、β-1,6分岐型β-1,3-グルカンはマンナン層と細胞膜との間と隔壁に局在し、β-1,6-グルカンは細胞壁全体、および、隔壁では細胞膜隣接部位に局在した。直鎖のβ-1,3-グルカンは隔壁の中央に直線的に局在し、隔壁形成過程では中心的な働きをした。また、アクチン細胞骨格が細胞膜の陥入の先端や形成過程の隔壁の先端、および、陥入部の基部に局在した。
4)S.pombe野生株およびアクチン点変異株cps8から単離した細胞膜を酵素源、UDP-グルコースを基質として、cell free系におけるグルカンの生合成を行い、グルカン・ネットワークの形成を検討した結果、アクチンを介したシグナル伝達系の必要性が解明された。
5)S.cerevisiaeにEGFPとアグルチニンの融合遺伝子を導入し、発現したタンパクの挙動を、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。融合タンパクは、細胞内と細胞壁に蛍光として観察された。坑GFP抗体を用いた免疫走査電子顕微鏡法により、細胞表層に融合タンパクを示すコロイド金が確認された。
以上の結果から外来遺伝子が細胞内で発現・輸送・分泌する機構と細胞壁構成分子の高次構造への形成機構の概要が解明され、新機能酵母をデザインするための基礎が確立された。
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