| 研究課題/領域番号 |
11140202
|
|---|
| 研究種目 |
特定領域研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
浜田 淳一 北海道大学, 医学部, 助教授 (50192703)
|
|---|
| 研究分担者 |
守内 哲也 北海道大学, 医学部, 教授 (20174394)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1999
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
1999年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
|
|---|
| キーワード | 酵母アッセイ法 / Wntシグナル / β-カテニン / リン酸化 / APC / TCF-4 / アキシン |
|---|
| 研究概要 |
β-カテニンのリン酸化異常を検出する酵母アッセイ法を開発するために、Wntシグナル伝達経路の酵母細胞内での再構成を試みた。
1.酵母染色体DNAへのレポータ遺伝子の導入
βカテニン・TCF-4複合体が標的遺伝子の転写を活性化する際、その遺伝子のプロモーター領域にあるTCF-binding element(TBE)に結合する。このTBEの下流にADE2遺伝子を連結したレポーター遺伝子を作製し、酵母の染色体に組み込んだ。
2.β-カテニン、アキシン、APC、TCF-4の酵母内発現ベクターの作製
宿主にはヒスチジン(His)、トリプトファン(Trp)、ロイシン(Leu)等の栄養要求性変異を有する酵母株を用いた。酵母発現ベクターにはそれぞれのアミノ酸非要求性となる遺伝子を組込んだ3種類のベクターを使用した。ガラクトース添加培地でのみ転写がおこるようにプロモーターにはGAL1を用い、その下流にβ-カテニン、アキシン、APCあるいはTCF-4の全長cDNAを組込んだ。次に各々のベクターを単独で酵母に導入し、ガラクトース存在下で蛋白発現が誘導されることをウエスタンブロット法で確認した。
3.レポーター遺伝子導入酵母でのβ-カテニンとTCF-4の発現
上記1で作製したレポーター遺伝子導入酵母株に2で作製したβ-カテニン発現ベクターとTCF-4発現ベクターの両方を導入した。免疫沈降法とウエスタンブロット法の解析により、酵母内でのβ-カテニンとTCF-4複合体の形成が確認された。
以上、Wntシグナル伝達経路に関与する分子を酵母内で発現させることに成功した。次のステップとして、これらの分子間相互作用の解析が必要となる。
|
