| 研究概要 |
ColE2プラスミドのRep蛋白質は,複製開始蛋白質が塩基配列特異的プライマーRNA合成活性を示すものとして今のところ唯一のものである.Ori結合に関与するドメインの少なくとも一つはC末端部分に近い領域に存在する.本研究では,ColE2のRep蛋白質とOri部位の種々の機能ドメインの同定,Rep-Ori結合の様式,複製開始機構の解明,さらにRep蛋白質を含む複製開始複合体の検出とその構造の解明などを目指して研究を行った.
1.Ori部位内の全残基にそれぞれ塩基置換を導入した変異Ori部位の作製を完了し,それらのin vivoのRep蛋白質結合能と複製開始能を詳細に検討した.(1)3つの機能領域の境界を確定できた.(2)強いRep-Ori結合が複製開始頻度を低く保つのに重要であることを確認できた.(3)in vitroのDNA合成系を用いて,種々の変異Ori部位のDNA複製開始活性を調べた.
2.Rep蛋白質の構造上、機能上のドメインの推定する目的で,Rep蛋白質の全領域にわたる置換変異を得るための種々の変異rep遺伝子の作製を試みた.変異Rep蛋白質のin vivoでのDNA複製能,Ori結合能および野生型Rep蛋白質に対する阻害能を測定する系を確立した.(1)多くの1アミノ酸置換変異を得る方法が確立できた.(2)primer RNA合成に関与する領域をほぼ確定できた.この領域には,原核生物のプライマーゼに共通の金属イオン結合配列と思われるアミノ酸配列が存在する.
3.SpainのPerera博士とAparicio氏との共同研究において,Thiobacillus由来のpT32.1の二つのRep蛋白質の内,大分子量の方に(推定される)Ori特異的結合能を見い出した.
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