| 研究課題/領域番号 |
11153210
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
市川 厚 京都大学, 薬学研究科, 教授 (10025695)
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| 研究分担者 |
田中 智之 京都大学, 薬学研究科, 助手 (40303846)
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| 研究期間 (年度) |
1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1999年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 翻訳後ターゲティング / ヒスチジン脱炭酸酵素 / 熱ショック蛋白 / 小胞体移行シグナル / GST融合タンパク / pull-down assay法 / ラット好塩基球細胞株 / GFP融合タンパク |
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| 研究概要 |
本年度の研究実施計画に基づき、以下の研究成果を得た。
1.翻訳後ターゲティングの調節機構の解析:
[^<35>S]メチオニン標識ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)を調製し、細胞質成分と反応させて標識HDCのイヌ膵臓ミクロソーム膜への移行を検討した。その結果、HDCの移行反応にATPの加水分解反応が必要であることがわかった。また、抗Hsc70抗体を用いての免疫沈降実験により、HDCの移行反応に熱ショック蛋白のHsc70が関与していることを明らかにした。
2.小胞体移行シグナルの同定:
すでに、これまでの実験で、小胞体移行におけるHDCのC-末端鎖の関与を明らかにしている。本年は、C-末端鎖の移行シグナルを有するドメインが、C-末端鎖の588番目から607番目までの20アミノ酸残基であることを明らかにした。さらに、このドメインを含むC-末端鎖ペプチドをGFP融合タンパクとして作成し、蛍光抗体法により細胞観察を行うことにより、20アミノ酸残基を含むC-末端鎖ドメインが小胞体に移行することを確認した。
3.翻訳後ターゲティングに関与する分子シャペロンの検索:
GST融合タンパクを用いたpull-down assay法により、ラット好塩基球細胞株RBL-2H3の細胞質から、HDCのC-末端鎖ドメインに結合する2種類のタンパク質(分子量70kDaおよび60kDa)を見出した。さらに、HDCのC末端鎖ペプチドから小胞体移行シグナルである20アミノ酸残基を除くと、上記2種類のタンパク質の示す結合活性は消失することを明らかにした。
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