| 研究課題/領域番号 |
11156204
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
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| 研究分担者 |
中村 彰男 群馬大学, 医学部, 助手 (30282388)
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| 研究期間 (年度) |
1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1999年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | ミオシン / カルシウム結合 / モ-タ-・ドメイン / 発現蛋白質 / 粘菌 |
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| 研究概要 |
本研究はCa^<2+>結合性があるフィザルム・ミオシン重鎖の「モーター・ドメイン」(「制御ドメイン」を含む)を組換体発現蛋白質として得て、軽鎖を組み込ませS1を再構成しようとするものである。1)「制御ドメイン」はCa^<2+>結合性を有する(但し、Ca^<2+>の作用は逆である)ホタテ貝ミオシンの成功例にならい、私どもは大腸菌で発現させることに成功した。軽鎖を組み込んだ上で、結晶化を試み、重電子置換→X線解析により高分解能で立体構造を決定できる途が開かれることになる。結晶化はCa^<2+>存在かで行われるので、ホタテ貝では「on」の状態で結晶化されている。フィザルムでは「off」の情報を与えることになる。2)「モーター・ドメイン」をメチロトローフ酵母の系を用い分離蛋白質として大量に得る。軽鎖を組み込んだ上、Motility assayにより機能を検定する。特に、ホタテ貝ミオシン軽鎖とのhybridによるCa^<2+>の作用の変化を検出する点に重点をおく。
本年度の成果は「制御ドメイン」の大腸菌内の発現については以下の成果が得られた。1)昨年まで得られたフィザルム・ミオシンcDNAのうち、制御ドメインを構成する(28K)ドメインのcDNAをPCR法により増幅した。2)PCR産物を強力なT7プロモーターを有するプラスミド:pET21に組み込んだ。3)必須軽鎖cDNAの1〜4のドメインに変位をかけたconstructを作成した。4)制御軽鎖cDNA及び1)を合わせて、大腸菌(BL21株)に導入した。5)このようにして必須軽鎖のミュータントを含む制御ドメインができた。6)大量培養により5)を精製した。7)流動透析法によりCa^<2+>結合を測定した。8)以上より必須軽鎖のうちドメイン1がCa^<2+>結合に重要であると判明した。
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