カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による脳由来神経栄養因子産生の調節機構

• 研究課題/領域番号: 11157226
• 研究種目: 特定領域研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 山本 秀幸 熊本大学, 医学部, 講師 (60191433)
• 研究分担者: 笠原 二郎 熊本大学, 医学部, 助手 (10295131) ; 福永 浩司 熊本大学, 医学部, 助教授 (90136721) ; 宮本 英七 熊本大学, 医学部, 教授 (50109659)
• 研究期間 (年度): 1999
• 研究課題ステータス: 完了 (1999年度)
• 配分額: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 1999年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
• キーワード: NG108-15細胞 / カルシウム / カルモデュリン / カルモデュリンキナーゼII / 神経細胞死 / 転写調節 / 脳由来神経栄養因子(BDNF) / プロモーター解析

研究概要

脳由来神経栄養因子(BDNF)は脳内に多量に発現しており、神経細胞に対し、強い生存維持活性をもつことが知られている。これまでに電位依存性Ca^<2+>チャネルの開口に伴う神経細胞内へのCa^<2+>の流入がBDNFのmRNAの発現を増加することが報告されていた。今回、本反応にCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素II(CaMキナーゼII)が関与する可能性について検討した。すなわち、モデル系として、CaMキナーゼIIの中で神経細胞の核内に存在するアイソフォームであるアルファBやデルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させた。1.NG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2.定量RT-PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>1チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、IV-BDNFのmRNAが増加した。3.アルファBやデルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加が有意に増強された。核内に移行しないデルタ1の過剰発現では増強効果は認められなかった。4.酵素のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5.ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とし、IV-BDNFのプロモーター活性を検討した。ルシフェラーゼ活性はアルファBやデルタ3の過剰発現により増強された。6.免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にアルファBやデルタ3を過剰発現する細胞のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。
今回の結果から、神経細胞内へのCa^<2+>の流入によるBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、神経細胞死の防御への応用を検討する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Takeuchi. Y.: "Nuclear localization of the δ subunit of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat cerebellar granule cells."J. Neurochem.. 72. 815-825 (1999)
• [文献書誌] Ohmitsu, M.: "Phosphorylation of myristoylated alanin-rich protein kinase C substrate by mitogen-activated protein kinase in cultured rat hippocampal neurons following stimulation of glutamate receptors."J. Biol. Chem.. 274. 408-417 (1999)
• [文献書誌] Matsumoto, K.: "Cloning from insulinoma cells of synapsin I associated with insulin secretory granules."J. Biol. Chem.. 274. 2053-2059 (1999)
• [文献書誌] Nakai, M.: "Amyloid β protein (25-35) phosphorylates MARCKS through tyrosine kinase-activated protein kinase C signaling pathway in microglia."J. Neurochem.. 72. 1179-1186 (1999)
• [文献書誌] Masuko, N.: "Interaction of NE-dlg/SAP102, a neuronal and endocrine tissue-specific membrane-associated guanylate kinase protein, with calmodulin and PSD-95/SAP90. A possible regulatory role in molecular clustering at synaptic sites."J. Biol. Chem.. 274. 5782-5790 (1999)
• [文献書誌] Nishiyama, Y.: "A human homolog of Drosophila warts tumor suppressor, h-warts, localized to mitotic apparatus and specifically phosphrylated during mitosis."FEBS Lett.. 459. 159-165 (1999)
• [文献書誌] Liu, J: "Differential roles of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II and mitogen-activated protein kinase activation in hippocampal long-term potentiation."J. Neurosci.. 19. 8292-8299 (1999)
• [文献書誌] Ogata, N.: "Involvement of protein kinase C in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-κB in human endothelial cells."Cardiovasc. Res.. 45. 513-521 (2000)
• [文献書誌] Takeuchi, Y.: "Increase of brain-derived neurotropic factor gene expression in NG108-15 cells by the nuclear isoforms of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II."J. Neurochem.. (in press). (2000)
• [文献書誌] Takeuchi, Y.: "Identification of the isoforms of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat astrocytes and their subcellular localization."J. Neurochem.. (in press). (2000)