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種々の細胞において新しく生合成された酸性加水分解酵素は、N-アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ(GPT)とホスファターゼの作用によりマンノース6リン酸残基を付加され、これらがマンノース6リン酸結合タンパク質に結合してリソソームに輸送される。この際、GPTは、リソソームタンパク質上に存在するある特定の立体構造を認識し、そのタンパク質の糖鎖に作用することが判明しているが、具体的な被認識部位の構造は未だ解明されていない。
最近我々は、COS細胞を用いた分泌性の糖タンパク質DNaseIの発現実験において、ウシDNaseIの27と74位にリジン残基に置換した変異DNaseIは、リソソームタンパク質とほぼ同等のマンノース6リン酸化されることを発見した。そして、マウスとウシの各種キメラDNaseIとりGPTの認識を阻害するアミノ酸残基の存在も見いだした。また、大腸菌で発現させた部位特異的置換ウシDNaseIを本来のリソソームタンパク質であるユテロフェリンと精製GPTのin vivoにおける反応系に反応阻害剤として加える実験系を用いて、27位や74位のリジン残基以外にも幾つかの認識に重要な役割を果たすアミノ酸を見いだした。
一方、このようなGPTの基質タンパク質認識機構だけでなく、本年度は糖鎖部分に対する構造特異性も検討した。ハイマンノースタイプの糖鎖をニワトリの卵より大量に精製し、糖鎖の還元末端を2-アミノピリジンで蛍光標識したものをマンノシダーゼなどで処理し、目的とする様々な構造の糖鎖を分離・調整した。精製GPTとこれらとを反応させ、生成物を逆相カラムで分離分析することにより、酵素の基質特異性を検討した。その結果、これまねGPTは反応しないと考えられていたマンノース9個にグルコースの結合したオリゴ糖にも反応し、GPTのよい基質となることが判明した。
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