| 研究概要 |
AtSec22pとF20P5.18pに対応するcDNAをアラビドプシスのcDNAライブラリーを鋳型としPCR法を用いて所得すると共に,全鎖長AtBet1p cDNA 122L18T7を入手した。これらの塩基配列を確認後、可溶性ドメインとGSTとの融合タンパク質を大腸菌で生産させるためのプラスミドを構築し、GST融合タンパク質を生産した。簡単に大腸菌で大量生産可能であったAtSec22p-GST融合タンパク質から、AtSec22p部分を所得しウサギを用いて抗AtSec22p抗体を作製した。大腸菌での生産中に分解産物が生じるAtBet1pおよびF20P5.18pとGSTとの融合タンパク質は、大腸菌産物よりの数段階の精製が必要であったため調製に手間取り、現在これらに対する抗体を作成中である。
アラビドプシス葉、根およびタバコ培養細胞BY-2株の抽出液中のタンパク質に対して、抗AtSec22p抗体を用いて免疫ブロッテイングを行ったところ、これらすべてにおいて、AtSec22pの大きさに相当するバンドが認められた。この抗体反応性のポリペプチドは遠心の沈澱画分に共に回収され可溶性画分には回収されなかったことから、分泌系関連の膜系に存在していると考えられた。BY-2株より調製した100,000xg沈澱画分に回収される膜系をショ糖連続密度勾配遠心で分画し、抗AtSec22p反応性20kDaポリペプチドの局在部位の検討を行い、予備的な結果ではあるがこのポリペプチドは粗面小胞体とゴルジ装置に分布する結果をを得ている。
また、小胞形成実験には小胞体より輸送されるタンパク質のみならず、小胞体に止まるタンパク質もコントロールとして必要である。そこで、ゲノムプロジェクトにより見い出されたシグナルペプチド認識穎粒レセプターのホモログをコードするcDNAを始めとした、数種のマーカー候補のcDNAの単離を行っている。
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