集合系マシーナリーとしての微生物の芳香環分解代謝系の構造生物学

• 研究課題/領域番号: 11169215
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 野中 孝昌 (2001-2002) 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (30242457); 千田 俊哉 (1999-2000) 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• 研究分担者: 政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (20272867) ; 福田 雅夫 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (20134512) ; 野中 孝昌 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (30242457)
• 研究期間 (年度): 1999 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 85,400千円 (直接経費: 85,400千円); 2002年度: 6,300千円 (直接経費: 6,300千円); 2001年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円); 2000年度: 28,800千円 (直接経費: 28,800千円); 1999年度: 43,800千円 (直接経費: 43,800千円)
• キーワード: 転写調節因子 / LysRファミリー / X線結晶構造解析 / 反応機構 / 誘導物質 / 酸化ストレス反応 / システイン生合成 / 蛋白質 / ジオキシゲナーゼ / ビフェニル / 酵素 / 触媒反応 / PCB / 蛋白結晶学 / 立体構造 / 生物マシーナリ / ポリ塩化ビフェニル / 構造活性相関 / 2原子酸素添加酵素 / PCB分解系 / LysR family蛋白質 / extradiol型のdioxygenase / 基質特異性 / ferredoxin reductase / 電子伝達系 / biphenyl dioxygenase / 放射光

研究概要

多波長異常分散法によりCbnRの構造解析を行うため、大腸菌を用いてセレノメチオニン置換体のCbnRを大量発現させ、精製を行った。ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、セレノメチオニン置換体のCbnRの結晶を得た。その結晶の空間群はP2_12_12で、格子定数はa=71.22Å, b=100.87Å, c=87.73Åであった(form I)。また、空間群P2_12_12_1、格子定数a=65.27Å, b=124.47Å, c=166.81Å(form II)と空間群P2_12_12、格子定数a=64.51Å、b=149.14Å, c=60.52Å(form III)の結晶も得られた。多波長異常分散法によりform I結晶からCbnRの位相を決定し、その後得られた2.2Åの高分解能回折データを用いて結晶学的精密化を行った。最終的にR=0.22、R_<free>=0.25の結晶構造を得た。そして、form I CbnRの調節ドメインの原子座標を用いて、分子置換法によりform IIとIIIのCbdRの結晶構造を決定した。CbnRの結晶構造は、LTTR(LysR-type transcriptional regulator)で初めて明らかにされた全長構造の立体構造である。その立体構造は、N末端側のDNA結合ドメインとC末端側の調節ドメインが29残基のアミノ酸からなる長いα-helix(linker belix)でつながれていた。CbnRのDNA結合モチーフは、Winged belix-turn-helixモチーフに分類されることがわかった。CbnRの調節ドメインの立体構造はCysBとOxyRのものと類似しており、α/β構造を持つサブドメイン2つで構成されていた。

研究成果

• [文献書誌] Sato, N., Uragami, Y., Nishizaki, T., Takahashi, Y., Sazaki, G., Sugimoto, K., Nonaka, T., Masai, E., Fukuda, M., Senda, T.: "Crystal structures of the reaction intermediate and its homologue of an extradiol-cleaving catecholic dioxygenase"Journal of Molecular Biology. 321(4). 621-636 (2002)
• [文献書誌] Muraoka, S., Okumura, R., Uragami, Y., Nonaka, T., Ogawa, N., Miyashita, K, Senda, T.: "Purification and crystallization of a LysR-type transcriptional regulator CbnR from Ralstonia Eutropha NH9"Protein and Peptide Letters. 10(in press). (2003)
• [文献書誌] Muraoka, S., Okumura, R., Ogawa, N., Nonaka, T., Miyashita, K., Senda, T.: "Crystal structure of a full-length LysR-type transcriptional regulator, CbnR : unusual combination of two subunit forms and molecular bases for causing and changing DNA bend"Journal of Molecular Biology. (in press). (2003)
• [文献書誌] Nandhagopal, N., Yamada, A., Hatta, T., Masai, E., Fukuda, M., Mitsui, Y., Senda T.: "Crystal structure of 2-hydroxyl-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid(HPDA)hydrolase(BphD enzyme)from the Rhodococcus sp.strain RHA1 of the PCB degradation pathway"J.Mol.Biol.. 309(5). 1139-1151 (2001)
• [文献書誌] Uragami, Y., Senda, T., Sugimoto, K., Sato, N., Nagarajan, V., Masai, E., Fukuda, M., Mitsu, Y.: "Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ri ng-cleavage dioxygenase"J.Inorg.Biocheim.. 83(4). 269-279 (2001)
• [文献書誌] Ohnishi,Y.: "Crystal structure of recombinant native SDF-1α with additional mutagenesis studies-An attempt for more comprehensive interpretation of accumulated structure-activity relationship data-"J.Interferon and Cytokine Res. 20. 691-700 (2000)
• [文献書誌] Uragami,Y.: "Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase."J.Inorg.Biochem.. (In press).
• [文献書誌] Yamada,T.: "Purification and crystallization of a ferredoxin reductase component of a biphenyl dioxygenase derived from Pseudomonas sp.strain KKS102."Protein Peptide Lett.. 7. 227-280 (2000)
• [文献書誌] Senda,T.: "Crystal structure of NADH-dependent ferredoxin reductase component in biphenyl dioxygenase"J.Mol.Biol.. 304. 397-410 (2000)
• [文献書誌] 福田雅夫: "環境汚染物質を分解する酵素の分子生物学-エクストラジオールジオキシゲナーゼにみられる多様性と収斂進化-"蛋白質・核酸・酵素. 45. 1339-1349 (2000)
• [文献書誌] 千田俊哉: "生物マシーナリー研究"結晶学会誌. 43. 38-44 (2001)
• [文献書誌] Sugimoto, K.: "Purification and crystallization of a protocatechuate 4,5-dioxygenase LigAB from Sphinggomonas pausimobilis SYK-6"Protein and Peptide Lett.. 6. 55-58 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto, K.: "Crystal structure of an aromatic-ring opening dioxygenase LigAB, a protocatechuate 4,5-dioxygenase, in aerobic condition"Structure Fold Des.. 7. 953-965 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto, K.: "Purification and Crystallization of a Catechol 2,3-Dioxygenase PheB from Bacillus stearothermophilus BR219"Protein and Peptide Lett.. 6. 403-406 (1999)
• [文献書誌] Ohtsubo, Y.: "PcpA, which is involved in the degradation of pentachlorophenol in Sphingomonas chlorophenolica ATCC39723, is a novel type of ring-cleavage dioxygenase"FEBS Letters. 459. 395-398 (1999)
• [文献書誌] Matsumoto, T.: "Three-dimensional structure of the catalytic domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 at a very high resolution"Proc. Aca. Japan. B75. 269-274 (1999)
• [文献書誌] Taguchi, S.: "A cold-adapted protease engineered by experimental evolution system"J. Biochem. (Tokyo). 126(4). 689-693 (1999)
• [文献書誌] Fujimoto, K.: "Functionally important residues tyrosine-171 and serine-158 in sepiapterin reductase"Biochim. Biophys. Acta.. 1431(2). 306-314 (1999)
• [文献書誌] Peng X.: "Characterization of the meta-cleavage compound hydrolase gene involved in degradation of the lignin-related biphenyl structure by Sphingomonas paucimobilis SYK-6"Appl. Environ. Microbiol.. 65(6). 2789-2793 (1999)