サイトカインシグナル伝達経路の可視化

• 研究課題/領域番号: 11242205
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 九州大学 (2001); 久留米大学 (1999-2000)
• 研究代表者: 箕口 滋 (2000-2001) 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (60322757); 安川 秀雄 (1999) 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (60289361)
• 研究分担者: 吉村 昭彦 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (90182815) ; 神薗 慎太郎 久留米大学, 医学部, 助手 (30261077) ; 脇岡 徹 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (40330873) ; 大坪 素秋 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (10211799) ; 箕口 滋 大阪大学, 大学院・医学系研究科学術振興会, 特別研究員
• 研究期間 (年度): 1999 – 2001
• 研究課題ステータス: 完了 (2001年度)
• 配分額: 38,900千円 (直接経費: 38,900千円); 2001年度: 12,700千円 (直接経費: 12,700千円); 2000年度: 12,700千円 (直接経費: 12,700千円); 1999年度: 13,500千円 (直接経費: 13,500千円)
• キーワード: チロシンキナーゼ / サイトカイン / Ras / Raf / 蛍光顕微鏡 / 一分子観察 / EGF受容体 / 細胞内局在 / JAK / GFP / FRET / 1分子 / イメージング / p21 / アクチン

研究概要

我々は、細胞膜に多く局在する低分子量Gタンパク質H-Rasのシグナル伝達経路、下流のRafキナーゼ活性化の機構、シグナルの局在化機構の解明を目指している。本研究では、まず、生細胞中で、活性化されたH-RasをバルクのH-Rasと区別して1分子可視化する方法を開発した。それには、個々のH-Ras分子を可視化し、さらに、活性化しているH-Rasにだけ結合するRBD(Raf1のRas binding domain)の結合を見ることにした。このため、GFP-H-Rasを培養メラノサイトに発現させて1分子蛍光法によって可視化し、さらに、Alexaで蛍光標識したRBDを顕微注入し、YFPからAlexaへの1分子蛍光共鳴エネルギー移動(1分子FRET)を観察した。実際、リガンド刺激によって、生化学的解析でRasが活性化する事が示された時間帯に、FRETシグナルが顕著に増加した。さらに、FRETを起こしている分子は、FRETを起こしていない(あるいは刺激前の)分子に比べて運動性が1/100以下と劇的に減少し、ほとんど停止した(活性化していないH-Rasの拡散運動はリン脂質並に早い)。常時活性化型H-Ras変異体では、動いていない分子の割合が多かった。Rasの下流には増殖シグナルの他に、細胞骨格の再編成など空間的情報が重要な経路があり、Rasの運動停止にはシグナル入力の位置情報を保持する意味があると考えられる。またRasと結合してRafの活性化を阻害する分子Spredのクローニングに成功した。この分子はRafの膜移行を阻害せず、むしろRafの細胞膜からの遊離を抑制することを分子イメージングによって明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Wakioka T, Sasaki A, et al.: "Spred is Sprouty-related suppressor of Ras signaling"Nature. 412. 647-651 (2001)
• [文献書誌] Hanada T, Yoshida T, Kinjyo I, Minoguchi S, et al.: "A mutant from of JAB/SOCS1 augments the cytokine-induced JAK/STAT pathway by accelerating degration of willd-type JAB/CIS family proteins through the SOCS-box"J. Biol. Chem.. 276. 40746-40754 (2001)
• [文献書誌] Sasaki A, Taketomi T, Wakioka T. et al.: "Identification of a dominant negative form of Sproutys that potentiates FGF-but not EGF-induced ERK activation"J. Biol. Chem.. 276. 36804-36808 (2001)
• [文献書誌] Yokouchi M, Kondo T, Sanlay A, et al.: "Srccaatalyzed phosphorylation of c-Cbl leads to the interdependent ubiauitination of both oroteins"J. Bid. Chem.. 276. 35185-35193 (2001)
• [文献書誌] Kamizono S, Handa T, Kato R, et al.: "The SOCS-1 accelerates ubiquition-dependent proteolysis of TEL-JAK2"J. Biol. Chem.. 276. 12530-12538 (2001)
• [文献書誌] Tauchi T, Yoshimura A, Ohyashiki K: "CIS1, a cytokine-inducible SH2 protein, suppresses BCR/ABL-mediated transformation. Involvement of the ubiquitin proteasome pathway"Exp. Hematol.. 29. 356-361 (2001)
• [文献書誌] Suzuki A, et al.: "CIS3/SOCS3/SSI3 Plays a Negative Regulatory Role in STAT3 Activation and Intestinal Inflammation."J.Exp.Med.. (in press).
• [文献書誌] Kamizono S, et al.: "The SOCS box of SOCS-1 accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of TELJAK2."J.Biol.Chem.. (in press).
• [文献書誌] Sporri B, et al.: "JAB/SOCS1/SSI-1 is an IL-2-induced inhibitor of IL-2 signaling."Blood . 97・1. 221-226 (2001)
• [文献書誌] Sako Y, et al.: "Single-molecule imaging of EGFR on the surface of living cells."Nat.Cell Biol.. 2・3. 168-172 (2000)
• [文献書誌] Sasaki A, et al.: "CIS3/SOCS3 suppresses erythropoietin signaling by binding the EPO receptor and JAK2."J.Biol.Chem.. 275・38. 29338-29347 (2000)
• [文献書誌] Masuhara M, et al.: "Molecular cloning of murine STAP-1, the stem cell-specific adaptor protein containing PH and SH2 domains."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 268・3. 697-703 (2000)
• [文献書誌] Marine JC,et al.: "SOCS3 Is Essential in the Regulation of Fetal Liver Erythropoiesis"Cell. 98・5. 617-627 (1999)
• [文献書誌] Sasaki A,et al.: "Cytokine-inducible SH2 protein-3(CIS3/SOCS3)inhibits Janus tyrosine kinese by binding through the N-terminal kinase inhibitory region as well as SH2 domain"Genes to Cells. 4・6. 339-351 (1999)
• [文献書誌] Yasukawa H,et al.: "The JAK-Binding Protein JAB inhibits Janus Tyrosine Kinase Activity Through Binding in the Activation Loop"EMBO J.. 18・5. 1309-1320 (1999)
• [文献書誌] Yokouchi M,et al.: "APS,an aduptor protein containing PH and SH2 domains,is associated with the PDGF receptor and c-Cbl and inhibits PDGF-induced mitogenesis"Oncogene. 18・3. 759-767 (1999)
• [文献書誌] Sako Y,et al.: "Single-molecule imaging of EGFR on the surface of living cells"Nat.Cell Biol.. 2・3. 168-172 (2000)
• [文献書誌] Minoguchi S,et al.: "Studies on the cell-type specific expression of RBP-L,a RBP-J familly member,by replacement insertion of beta-galactosidase"J.Biochem.(Tokyo). 126・4. 738-747 (1999)