cameleon1分子イメージングによる局所的カルシウム動態の解析

• 研究課題/領域番号: 11242208
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 宮脇 敦史 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー (80251445)
• 研究分担者: 深野 天 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 ; 濱 裕 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (30261796) ; 水野 秀昭 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 専門職研究員 (80301779) ; 河野 弘幸 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (10332256) ; 筒井 秀和 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 基礎科学特別研究員 ; 永井 健治 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (20311350)
• 研究期間 (年度): 1999 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 86,300千円 (直接経費: 86,300千円); 2003年度: 12,800千円 (直接経費: 12,800千円); 2002年度: 12,800千円 (直接経費: 12,800千円); 2001年度: 17,000千円 (直接経費: 17,000千円); 2000年度: 21,200千円 (直接経費: 21,200千円); 1999年度: 22,500千円 (直接経費: 22,500千円)
• キーワード: 蛍光タンパク質 / Digital Micromirror Device / ヒユサンゴ / シナプス形成 / インテグリン / グリア細胞 / プロテインキナーゼC / 発色団 / EGF / チロシンリン酸化 / 層流 / photoconversion / Kaede / GFP / YFP / cameleon / カルシウム / イメージング / 落射蛍光顕微鏡 / pericam / RFP / FRET / Ca^<2+>センサー / カルモデュリン / サファイア / 2光子励起 / エバネセント / 1分子イメージング / 蛍光エネルギー移動 / Green Fluorescent Protein / Red Fluorescent Protein

研究概要

当研究チームは2002年に、ヒユサンゴからクローニングした蛍光蛋白質カエデの、紫(外)光によって色が緑から赤に変換する特性を利用して、光で細胞をマーキングする技術を開発した。神経回路における神経細胞一個一個の全体像を浮かび上がらせたり、発生における細胞の系譜を追跡することに応用できることを証明した。さらに、緑と赤の状態のカエデたんぱく質の構造解析の結果、カエデたんぱく質の発色団が、その近傍のペプチド鎖切断に伴う構造変化によって緑色から赤色に変化するように広がることを解明した。そのペプチド鎖切断は、紫(外)光を吸収したカエデたんぱく質が触媒活性を発揮することによって実現するものと結論され、たんぱく質内で起こる光化学の新しい様相を発見することとなった。
・カエデ技術など光で操作する技術を、顕微鏡に盛り込む試みを行った。Digital Micromirror Device(PLUS社のプロジェクターから取り出した)を通常の顕微鏡の視野絞りに設置することによって、自由な証明パターンを可能にする光学システムを開発した。さらに縞投影法を組み合わせることによって、蛍光シグナルの断層像が容易に取得できる顕微鏡を作製した。
・神経細胞のシナプス形成がグリア細胞の存在によって促進されることは以前から知られている。「この効果がグリア細胞の接着因子あるいは液性因子、どちらによってもたらされるのか?」が問題にされてきた。これまで未開拓だった接着効果をはじめて体系的に証明した。神経細胞の局所に、インテグリンを介してグリア細胞が接着することで、プロテインキナーゼC系の活性化の伝播が起こり、神経細胞全体にわたってシナプス形成の顕著な亢進が起こることが証明された。

研究成果

• [文献書誌] Hama H., Hara C., Yamaguchi K., Miyawaki A.: "PKC Signaling Mediates Global Enhancement of Excitatory Synaptogenesis in Neurons Triggered by Local Contact with Astrocytes."Neuron. 41(3). 405-415 (2004)
• [文献書誌] Mizuno H, Mal TK, Tong KI, Ando R, Furuta T, Ikura M, Miyawaki A.: "Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein."Molecular Cell. 12(4). 1051-1058 (2003)
• [文献書誌] Miyawaki A., Sawano A., Kogure T.: "Lighting up cells : labelling proteins with fluorophores."Nature Cell Biology. 5. S1-S7 (2003)
• [文献書誌] Fukano T., Miyawaki A.: "Whole-field fluorescence microscope with digital micromirror device : imaging of biological samples."Applied Optics. 42(19). 4119-4124 (2003)
• [文献書誌] Karasawa S, Araki T, Yamamoto-Hino M, Miyawaki A.: "A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling."Journal of Biological Chemistry. 278(36). 34167-34171 (2003)
• [文献書誌] Miyawaki A: "Visualization of the Spatial and Temporal Dynamics of Intracellular Signaling."Developmental Cell. 4. 295-305 (2003)
• [文献書誌] Sawano A., Takayama S., Matsuda M., Miyawaki A.: "Lateral propagation of EGF signaling after local stimulation is dependent on receptor density"Developmental Cell. 3. 245-257 (2002)
• [文献書誌] Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Miyawaki A.: "An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein"Proceedings of the National Academy of Sciences. 99(20). 12651-12656 (2002)
• [文献書誌] Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A: "A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications"Nature Biotechnology. 20. 87-90 (2002)
• [文献書誌] Sawano A., Hama H., Saito N., Miyawaki A.: "Multi-color imaging of Ca^<2+> and protein kinase C signals using novel epi-fluorescence microscopy"Biophysical Journal. 82. 1076-1085 (2002)
• [文献書誌] Miyawaki A., Mizuno H., Nagai T., Sawano A.: "Development of genetically-encoded fluorescent indicators for calcium"Methods in Enzymology. (2002)
• [文献書誌] Shimozono S., Fukano T., Nagai T., Kirino Y., Mizuno H., Miyawaki A.: "Confocal imaging of subcellular Ca^<2+> concentrations using a dual excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein"Science STKE. (2002)
• [文献書誌] Mochizuki N., Yamashita S., Kurokawa K., Ohba Y., Nagai T., Miyawaki A., Matsuda: "Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rap1"Nature. 411(6841). 1065-1068 (2001)
• [文献書誌] Kurokawa K., Mochizuki N., Ohba Y., Mizuno H., Miyawaki A., Matsuda M.: "A pair of FRET-based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in Vivo"J Biol Chem. 276(33). 31305-31310 (2001)
• [文献書誌] Matsushita F.,Miyawaki A.,and Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the glands associated with the mouse vomeronasal organ : Identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. 268. 275-281 (2000)
• [文献書誌] Sawano A,and Miyawaki A.: "Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis"Nucleic Acids Research(アドレスhrrp://nar.oupjounals.org/cgi/reprint/28/16/e78.pdf). 28,No.16. e78 (2000)
• [文献書誌] Mizuno H.,Sawano A.,Eli P.,Hama H.and Miyawaki A.: "Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer"Biochemistry. 40(8). 2502-2510 (2001)
• [文献書誌] Nagai T.,Sawano A.,Park E.,and Miyawaki A.: "Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense to Ca^<2+>"Proceeding National Academy Science USA. 98(6). 3197-3203 (2001)
• [文献書誌] Miyawaki A., Tsien R. Y.: "Monitoring Protein Conformations and Interactions by Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Mutants of Green Fluorescent Protein"Methods in Enzymology, Chimeric Proteins. (1999)
• [文献書誌] Miyawaki A., Llopis J., Mizuno H., Jelink K., Tsien R. Y.: "Cameleons as cytosolic and intra-organellar calcium probes"Oxford University Press, Calcium Signaling : A Practical Approach. (1999)
• [文献書誌] Mikoshiba K., Furuichi T., Miyawaki A., et al.: "Role of Inositol 1, 4, 5-Trisphosphate(IP_3) Receptor/Ca^<2+> Signaling in Cell Function"Japan Scientific Societies Press, Challenges for Neuroscience in the 21^<st> Century. (1999)
• [文献書誌] Matsushita F., Miyawaki A., Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the gland associated with the mouse vomeronasal organ : identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. (2000)