| 研究概要 |
昆虫病原性微胞子虫6分離株(Nosema bombycis NIS001,Nosema sp.NIS M11,Nosema sp.TB2L1,Nosema mesnili,Microsporidium sp.TB2M1,Vairimorpha sp.NIS M12)の胞子を0.1N KOH中に浮遊し,27℃,30分処理後昆虫培養細胞に接種し,限界希釈法により各分離株から微胞子虫のクローン化株を樹立した。N.bombycis NIS001,Nosema sp.NIS M11,N.mesnili,Microsporidium sp.TB2M1,Vairimorpha sp.NIS M12はSpodoptera frugiperda SF21AEII細胞系でクローニングされたが, Nosema sp.TB2L1はBombyx mori BmX細胞系でのみクローンがえられた。
昆虫培養細胞系に人工発芽法で部分精製微胞子虫胞子をクローン毎に接種し,接種後から感染細胞中の微胞子虫をギームザ染色して,所定時間毎に観察した。ギームザ染色による微胞子虫の染色体観察は,微胞子虫の栄養型細胞(シゾント)の二分裂開始直後の時期が適していると判断された。また,微胞子虫の染色体と思われる構造は樹枝状で,光学顕微鏡観察による染色体数の算定はきわめて困難であるが,Vairimorpha sp.NIS M12はn=13のようで,半数体である可能性が高いと判断される。
種々の微胞子虫胞子からゲノムを抽出する手法を検討した結果,アルカリEDTA溶液(pH12.0)処理後,proteinaseK処理をする方法が最も有効であった。
本法によりゲノム抽出を行いパルスフィールド電気泳動を行ったところ,これまで異種とされていた分離株の泳動パターンは著しく異なっていた。しかしながら一部の分離株を除き,分子量及びシグナル強度との関連性は極めて低いものであった。以上の事より微胞子虫ゲノムDNAのパルスフィールド電気泳動による比較はクローン化した微胞子虫を用いゲノムの数,サイズではなく,同一条件下で抽出,泳動した場合のシグナル強度を考慮に入れたバンドパターンの比較により議論すべきであると結論付けた。
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