| 研究課題/領域番号 |
11460039
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
村田 幸作 京都大学, 農学研究科, 教授 (90142299)
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| 研究分担者 |
河井 重幸 京都大学, 農学研究科, 助手 (00303909)
橋本 渉 京都大学, 農学研究科, 助教授 (30273519)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
14,300千円 (直接経費: 14,300千円)
2001年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2000年度: 4,200千円 (直接経費: 4,200千円)
1999年度: 6,600千円 (直接経費: 6,600千円)
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| キーワード | スフィンゴモナス属細菌 / アルギン酸リアーゼ / 自己プロセッシング / プロテアーゼ / X線結晶構造 / β-脱離反応機構 / 遺伝情報多重性 / プロテオーム / 遺伝情報量 / 多触媒中心酵素 / 翻訳後修飾 / X線結晶構造解析 / アルギン酸 / Shingomonas属細菌 / プロテオーム解析 |
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| 研究概要 |
スフィンゴモナス属細菌A1株は、細胞質に3種類のアルギン酸リアーゼI, II, IIIを有する。これら3種類のリアーゼは、唯一の遺伝子にコードされており、先ず前駆体Po(71kDa)として合成された後、そのN末端ペプチド5kDaが切除され、Iが生じる。Iは、自己プロセッシングによって分子量と気質特異性をことにするIIとIIIに分断される。この分断は、EDTAやO-フェナンスロリンによって完全に阻害されることを明らかにし、この分断がIのプロテアーゼ様活性によることを示した。これにより、Iは、II, III及びプロテアーゼの3種類の酵素を搭載した多触媒中心酵素であることを確定した。Iのプロテアーゼ活性は、PoからN末端が除去されることによってIに賦与されることを示した。しかし、プロテアーゼ触媒部位がIの何処に、どのような情報として記述されているかが問題になる。つまり、アルギン酸リアーゼの合成系は、従来の定説である1遺伝子-1たんぱく質(酵素)の概念とは異なり、1遺伝子-3たんぱく質(酵素)の検証を可能にする実験系を提供し、1遺伝子の中に潜在する遺伝情報量の見直しを提起した。この問題点を明らかにするためには、I, II, IIIの構造機能相関解析が不可欠である。そこで、I, II, IIIのX線結晶構造の決定を進めた。Iは、結晶作製中に自己プロセシングによってIIとIIIに分断するため、構造決定までには至らなかった。IIの結晶は簡単に得られるが、1対象単位に多数の酵素分子が含まれているため、結晶構造解析には適さなかった。そこで、N末端を削除した変異酵素で結晶を調製した。IIIに関しては、詳細な触媒中心の構造と触媒機構を解析し、従来のヒスチジン関与の触媒機構を否定し、正確なチロシン関与の正確なβ-脱離反応機構を確立した。
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