| 研究課題/領域番号 |
11470470
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
化学系薬学
|
|---|
| 研究機関 | 九州大学 |
|---|
研究代表者 |
正山 征洋 九州大学, 薬学研究院, 教授 (70037604)
|
|---|
| 研究分担者 |
田中 宏幸 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (30253470)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1999 – 2001
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
|
| 配分額 *注記 |
11,000千円 (直接経費: 11,000千円)
2001年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
2000年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1999年度: 7,600千円 (直接経費: 7,600千円)
|
|---|
| キーワード | モノクローナル抗体 / 薬理活性配糖体 / イースタンブロテイング / アフィニテイーカラム / ワンステップ単離 / scFV遺伝子 / トランスジェニック植物 / 育種 / 活性配糖体 / 高感度アツセイ系 / ウエスタンブロッテイング / アフィニティークロマト / 小型化抗体遺伝子 / 高感度アッセイ系 / ウエスタンブロッティング / 発現 |
|---|
| 研究概要 |
本研究では生理活性を持つ生薬由来配糖体(ニンジンのジンセノシド、甘草のグリチルリチン、大黄のセンノシド類、柴胡のサイコサポニン類、サフランのクロセチン配糖体)をターゲットとして、それらに対するモノクローナル抗体(MAb)を作成してきた。それらを用いて高感度で特異性の高いアッセイ法を確立してきた。また、ソラソジン配糖体に対する抗体産生ハイブリドーマから小型化抗体遺伝子を作成し、小型化抗体(scFV)の作成に成功した。
ジンセノシド(G)に関してはGRb1,GRg1それぞれに対するMAbを作成し、新免疫染色法としてイースタンプロテイング法を確立した。本法により坑GRb1,GRg1MAbを用いた2重染色に成功した。本法によるとGRb1系統のGは青色、GRg1系統はピンク系統に染色される。従って発色とRf値によりGの構造を容易に類推することを可能にした。その他の配糖体についても同様な開発に成功した。
MAbを装着したアフィニテイーカラ厶の作成に成功した。坑GRb1MAbの場合、ニンジンエキスをカラムに付し、洗浄液、溶離液の順に添加すると、洗浄液によりGRb1以外の成分と過剰のGRb1が溶出する。次に溶離液によってGRb1のみが溶出し、ワンステップ単離に成功した。また、洗浄液中のG類はカラムを繰り返すことによりGRb1とGRcを分離可能なことが明らかとなった。
scFV遺伝子をハイブリドーマからmRNAを抽出し、転写酵素でcDNAとし、プライマーによりMAbの可変部分、VH, VL遺伝子をクローニングした。両者をリンカーで結合し、プラスミッドに挿入し、発現ベクターに組み換え、大腸菌でscFVタンパクを発現した。本遺伝子をソラソジン配糖体を産生するナス科植物へ導入し、ソラソジン配糖体の高含有株(約3倍)を作出した。
|
