| 研究課題/領域番号 |
11470498
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
環境系薬学
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
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| 研究分担者 |
松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
石垣 靖人 金沢大学, 薬学部, 助手 (20232275)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
15,400千円 (直接経費: 15,400千円)
2000年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
1999年度: 12,200千円 (直接経費: 12,200千円)
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| キーワード | モノクローナル抗体 / シクロブタン型ピリミジン二量体 / (6-4)光産物 / ドットブロット解析 / キャピラリー電気泳動 / 酵素標識免疫測定法 / デワー型光産物 / DNA損傷 / シクロブタン型ビリミジン二量体 / ヌクレオチド除去修復 / シクロブンタン型ピリミジンニ量体 / 蛍光標識抗体 |
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| 研究概要 |
紫外線(UVBとUVC)によって誘発される二量体型DNA損傷には、シクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)、(6-4)光産物(64P)とデワー型光産物(DwP)が含まれる。これら損傷は細胞死、突然変異とがん誘発に関わることから、その検出は太陽光紫外線中のUVBの影響を評価するに必須である。本研究では低線量紫外線によって誘発される遺伝子損傷検出を目的として下記の検出系の樹立を目指した。全ての検出系は我々がこれまでに樹立したDNA損傷を特異的に認識するモノクローナル抗体を利用した系である。
1.キャピラリー電気泳動法を利用した損傷の高感度検出系の開発
抗CPDモノクローナル抗体(TDM-2)を一次抗体とし、二次抗体にはAlexa Fluor標識goat anti-mouse IgG(H+L)を用いた。DNA損傷は損傷と一次・蛍光標識二次抗体の複合体をキャピラリー電気泳動後、488nmレーザー励起蛍光検出器(BioFocus 2000:Bio Rad)で検出した。DNAと一次抗体の非特異的結合を抑制するため反応バッファー中の塩濃度を高く設定した。ヒトA549細胞由来のゲノムDNAを分離し低線量紫外線(UVC、<10J/m^2)を照射した後損傷を検出した。その結果、0〜1J/m^2のレベルで紫外線線量に依存して検出複合体量が直線的に増加した。また、検出された複合体のピークが大腸菌由来光回復酵素処理によって低下したことから、損傷に結合した一次・二次抗体複合体であることが確認された。今後は本検出系を用いて0〜1J/m^2のレベルでの損傷の細胞内修復動態の解析を行う。
2.ECL(Enhanced Chemiluminescence)法を用いた増感酵素標識免疫測定法(ELISA)の樹立
損傷を高感度に検出することを目的として従来のELISA法を改良した。マイクロプレートにLumiNunc^<TM>を、化学発光基質としてSuperSignal^*ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce,IL)を用いた。その結果、0〜1J/m^2のUVC線量域で損傷の直線的検出が可能となった。従来の方法に比べ10〜20倍程度の検出感度の上昇が見られた。今後は64PとDwPの定量的検出に適用し、それら損傷の生物学的意義の解明に努めたい。
3.ドットブロット法を利用した損傷検出系の開発
plasmid DNAに各種の紫外線を照射し、種々の損傷修復タンパクで消化後、超螺旋型から開環型への変換を測定し検量線を描き、一方でECLを利用したドットブロット法を結合抗体の検出に利用して各種抗体が結合する損傷数を決定した。その結果、UVAランプの照射でCPDがDNA中に有意に誘発されること、DwPは人工太陽光紫外線照射で特異的に誘発され、CHO細胞中では64Pのそれとは異なってCPDと同様に遅い修復を示すことが分かった。従って太陽光紫外線に暴露された際の主たる損傷はCPDとDwPであり、それらは共に変異源性が高いことが示唆された。
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