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蛋白質間相互作用を利用した細胞内シグナル伝達分子の同定法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 11557015
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分展開研究
研究分野 病態医化学
研究機関東京大学 (2000-2001)
(財)癌研究会 (1999)

研究代表者

宮園 浩平  東京大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90209908)

研究分担者 今村 健志  (財)癌研究会, 癌研究所生化学部, 主任研究員 (70264421)
研究期間 (年度) 1999 – 2001
研究課題ステータス 完了 (2001年度)
配分額 *注記
12,700千円 (直接経費: 12,700千円)
2001年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
2000年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
1999年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
キーワードTGF-β / シグナル伝達 / 蛋白質間相互作用 / マススペクトロメトリー / Smad / DNAP / 骨形成因子 / 構造決定 / 質量分析 / アミノ酸配列
研究概要

蛋白質-蛋白質間の相互作用による細胞内シグナル伝達機構を明らかにするためにSmadに結合する蛋白質をマススペクトロメトリーで同定することを目的として実験を行った。Smad1〜8にFla-tagをつけたコントラクトを作り哺乳類細胞にトランスフェクションした。ついでアガロースピーズに結合した蛋白質をFlag抗体を用いて免疫沈降し、共沈する蛋白質を銀染色したSDS-PAGEから切りだし、トリプシン処理したのち、マススペクトロメトリーによってペプチドの質量を測定した。その結果、Rabファミリーのタンパク質がSmad1と結合することが明らかとなった。
Smad3はCAGAというモチーフに活性化された時にのみ結合することから、CAGA sequenceを用いてDNA affinity purification (DNAP)によるSmad3の回収を試みた。その結果、HaCaT細胞ではSmad3はTGF-βによって活性化されたときにのみ特異的にCAGA sequenceに結合し、さらにSmad2も共沈することが確認された。また転写共役因子であるp300やc-SkiがSmad3とともに回収できることが確認された。
結合タンパク質の特異的な回収のためにはPoly d(1-C)の濃度の決定、ビーヅの洗浄の条件、DNAとの反応時間の設定などが重要であることが確認された。またダイナビーヅを用いることによって、タンパク質を銀染色で調べた場合、劇的にバックグラウンドが低くなることが明らかとなった。以上からDNAPを用いることによって細胞内に存在するSmad結合タンパク質を活性化された時に特異的に効率良く回収できることが明らかとなった。

報告書

(4件)
  • 2001 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2000 実績報告書
  • 1999 実績報告書
  • 研究成果

    (24件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (24件)

  • [文献書誌] ten Dijke, P., et al.: "Signaling inputs converge on nuclear effectors in TGF-β signaling"Trends Biochem. Sci.. 25・2. 64-70 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "Positive and negative regulation of TGF-β signaling"J. Cell Sci. 113・7. 1101-1109 (2000)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "TGF-β signaling by Smad proteins"Cytokine Growth Factor Rev.. 11・1-2. 15-22 (2000)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "TGF-β/SMAD signaling and its involvement in tumor progression"Biol. Pharm. Bull.. 23・10. 1125-1130 (2000)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K. et al.: "Divergence and convergence of TGF-β/BMP signaling"J. Cell. Physiol.. 187・3. 265-276 (2001)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "A new partner for inhibitory Smads"Cytokine Growth Factor Rev.. 13・1. 7-9 (2002)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ten Dijke, P., et al: "Signaling inputs converge on nuclear effectors in TGF-β signaling"Trends Biochem. Sci.. 25・2. 64-70 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "Positive and negative regulation of TGF-β signaling"J. Cell Sci. 113・7. 1101-1109 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "TGF-β signaling by Smad proteins"Cytokine Growth Factor Rev.. 11・1-2. 15-22 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "TGF-β/SMAD signaling and its involvement in tumor progression"Biol. Pharm. Bull.. 23・10. 1125-1130 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K., et al: "Divergence and convergence of TGF-β/BMP signaling"J. Cell. Physiol.. 187・3. 265-276 (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "A new partner for inhibitory Smads"Cytokine Growth Factor Rev.. 13・1. 7-9 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2001 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Miyazono, K., et al.: "Divergence and convergence of TGF-β/BMP signaling"J. Cell. Physiol.. 187・3. 265-275 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Furuhashi, M., et al.: "Axin facilitates Smad3 activacion in the transforming growth factor-β signaling pathway"Mol. Cell. Biol.. 21・15. 5132-5141 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Kusanagi, K., et al.: "α-Helix 2 in the amino-terminal Mad homology 1 domain is responsible for specific DNA-binding of Smad3"J. Biol. Chem.. 276・30. 28155-28163 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono, K.: "A new partner for inhibitory Smads"Cytokine Growth Factor Rev.. 13・1. 7-9 (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 宮澤 恵二, 横手 幸太郎, 宮園 浩平: "新 細胞増殖因子のバイオロジー"羊土社. 159 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono,K.,ten Dijke,P.,and Heldin,C.-H.: "TGF-b signaling by Smad proteins."Adv.Immunol.. 75. 115-157 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono,K.: "TGF-b signaling by Smad proteins."Cytokine Growth Factor Rev.. 11(1-2). 15-22 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono,K.: "Positive and negative regulation of TGF-b signaling."113(7). 1101-1109 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono,K.,Kusanagi,K.,and Inoue,H.: "Divergence and convergence of TGF-b/BMP signaling."J.Cell.Physiol.. (in press). (2001)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Kusanagi K.,Inoue H.,Miyazono K.et al.: "Characterization of a bone morphogenetic protein-responsive Smad binding element"Mol.Biol.Cell. 11(2). 555-565 (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Ishida W.,Hamamoto K.,Miyazono K.et al.: "Smad6 is a Smad1/5-induced Smad inhibito r: Characterizaion of bone morphogenetic protein-responsive element in the mouse Smad6 promoter"J.Biol.Chem.. 275(9). 6075-6079 (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Miyazono K.,ten Dijike,P.and Heldin C.-H.: "TGF-b signaling by Smad proteins"Adv.Immunol.. (in press). (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書

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公開日: 1999-04-01   更新日: 2016-04-21  

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