| 研究課題/領域番号 |
11557181
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
宮澤 恵二 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (40209896)
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| 研究分担者 |
下村 猛 三菱東京製薬, 創薬基盤研究所, 主管研究員
喜多村 直実 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (80107424)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
13,000千円 (直接経費: 13,000千円)
2000年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
1999年度: 9,500千円 (直接経費: 9,500千円)
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| キーワード | プロテアーゼ / 組換えタンパク質 / 限定分解 / 融合タンパク質 |
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| 研究概要 |
組換えタンパク質をtagとの融合タンパク質として発現した際、tagを切り離す限定分解のステップには特異性・反応効率ともに高いプロテアーゼの使用が望ましい。本研究はこのステップに肝細胞増殖因子活性化酵素(Hepatocyte Growth Factor Activator;HGFA)を用いて実用的な系を構築することを試みた。
まず、始めにHGFA基質ペプチド配列をGST融合タンパク質へと導入した。pGEX4T-3ベクターのトロンビン切断配列の下流に、HGFA切断配列(AKTKQLRVVNG)をコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。つぎに細胞内のシグナル伝達分子であるJIP-1(JNK interacting protein-1)を用いて発現実験をおこなった。発現した融合タンパク質(GST-JIP1)をトロンビンおよびHGFAにより基質酵素比50:1の条件にて37℃、4時間処理をおこなった。トロンビン処理によりGST-JIP1はGST部分を残して完全に分解された。いっぽう、HGFA処理ではリンカー部分の切断のみがおこった。この他に肝細胞増殖因子バリアントNK1、肝細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼドメインについて、このシステムを用いた発現と切断をおこなった。いずれも副反応による分解は見られなかった。また、HGFAによる限定分解の制約条件を検討した。HGFAの活性はglutathioneの共存によっては低下しなかった。すなわち、精製したGST融合タンパク質は前処理なしに分解反応をおこなえることがわかった。しかし、0.5Mから2Mまでのurea共存下でHGFAの活性は完全に抑制された。したがって、ureaで可溶化したサンプルの切断には、前もって十分にureaを除去する必要がある。
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