Gene tip micro arrayの遺伝子診断への応用

• 研究課題/領域番号: 11557201
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 展開研究
• 研究分野: 人類遺伝学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 鈴木 洋一 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (80216457)
• 研究分担者: 成澤 邦明 (成沢 邦明) 東北文化学園大学, 医療福祉学部, 教授 (90004647)
• 研究期間 (年度): 1999 – 2000
• 研究課題ステータス: 完了 (2000年度)
• 配分額: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円); 2000年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 1999年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
• キーワード: DNAマイクロアレー / 先天代謝異常 / ビオチン / ホロカルボキシラーゼ合成酵素 / 筋ジストロフィー / 遺伝子診断

研究概要

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)遺伝子の異常の70%は複数のエクソンをも含む大きな欠失であり、マルチプレックスPCR法による診断も可能であるが、診断率は十分とはいえず、新たな方法の開発が望まれてきた。本研究ではDNAマイクロアレーを用いたエクソンの欠失、スプライス異常の検出を試みた。
DNAマイクロアレーは日本レーザのGTMASSスタンピング装置を用い、ポリLリジンコートのスライドグラス上にジストロフィン遺伝子のすべての翻訳エクソンを増幅したDNA断片を固定した。ターゲットDNAは、正常およびDMD患者のリンパ芽球のtotalRNAからジストロフィンmRNAの翻訳領域を10分割してRT-PCRをおこない、増幅した。PCR時にCy5dUTPを取り込ませることで、ターゲットDNAはCy5標識している。ハイブリダイゼーションは複数の蛍光標識ターゲットcDNAを混合し、各エクソンを固定したスライドグラスと共にインキュベーションすることで行った。
正常リンパ芽球のcDNAのフラグメント7はエクソン43から51を含んでいるが、これをマイクロアレーに対しハイブリダイゼーションを行うとエクソン43から51までのエクソンのスポットの蛍光が認められた。一方、マルチプレックスPCRにて、既にエクソン44の欠失が疑われていた患者のDNA断片について同様の実験を行うと、エクソン44に相当する蛍光スポットのみの蛍光が検出されないことが分かった。この結果から、本DNAマイクロアレーはDMDの遺伝子診断法として利用可能であることが示唆された。
一方、オリゴヌクレオチドをスライドグラスに結合させ、アリル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法を試みたが、蛍光標識DNAが検出できるほどの感度にオリゴヌクレオチドのガラス面への結合ができず、1塩基の変化の検出には今後の更なる条件検討が必要と思われた。

研究成果

• [文献書誌] Yang X, et al.: "Haplotype analysis suggest that the two predominant mutations in Japanese patients with holocarboxylase synthetase deficiency are founder mutations."J.Hum.Genet.. 45;6. 358-362 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sakamoto O, et al.: "Diagnosis and mutation analysis of an atypical case of holocarboxylase synthetase deficiency"Europian Journal of Pediatrics. 159;1-1. 18-22 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Aoki, Y., Li, X., Sakamoto, O., Hiratsuka, M., Akaishi, H., Xue, L., Briones, P.Suormala, T., Baumgartner, R., Suzuki, Y., and Narisawa, K.: "Identification and characterization of mutations in patients with holocarboxylase synthetase deficiency."Human Genetics. 104. 143-148 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hou, D., Kure, S., Suzuki, Y., Hasegawa, Y., Hara, Y., Inoue, T., Kida, Y., Matsubara, Y., Narisawa, K.: "Glycogen storage disease type Ib : structural and mutation analysis of the microsomal glucose-6-phosphate transporter gene."Am.J.Med.Genet. 86. 254-257 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sakamoto, O., Suzuki, Y., Aoki, Y., Li, X., Hiratsuka, M., Suormala, T, Baumgartner, R., Gibson, M., and Narisawa, K.: "Relationship between kinetic properties of mutant enzymes and biochemical and clinical responsiveness to biotin in holocarboxylase synthetase deficiency."Ped.Res.. 46. 671-676 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sakamoto, O., Suzuki, Y., Li, X., Aoki, Y., Hiratsuka, M., Holme, E., Kudoh, J., Shimizu, N., and Narisawa, K.: "Diagnosis and mutation analysis of an atypical case of holocarboxylase synthetase deficiency."Eur.J.Pediatr.. 159. 18-22 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujii K, Matsubara Y, Akanuma J, Takahashi K, Kure S, Suzuki Y, Imaizumi M, linuma K, Sakatsume O, Rinaldo P, Narisawa K: "Mutation detection by TaqMan-allele specific amplification : Application to molecular diagnosis of glycogen storage disease type la and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency"Hum.Mutat.. 15. 189-196 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hwu WL, Suzuki Y, Yang X, Li X, Chou SP, Narisawa K.: "Tsai WY Late-onset holocarboxylase synthetase deficiency with homologous R508W mutation."J.Formos.Med.Assoc.. 99. 174-177 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Akanuma, J., Nishigaki, T.Fujii, K., Matsubara, Y., Inui, K., Takahashi, K., Kure, S., Suzuki, Y., Ohura, T., Miyabayashi, S., Ogawa, E., linuma, K., Okada, S., Narisawa, K.: "Glycogen storage disease type la : molecular diagnosis of 51 Japanese patients and characterization of splicing mutations by analysis of ectopically transcribed mRNA from lymphoblastoid cell."J.Med.Genet.. 91. 107-112 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Okubo, M., Horinishi, A., Suzuki, Y., Murase, T., Hayasaka, K.: "Compound Heterozygous Patient With Glycogen Storage Disease Type III : Identification of Two Novel AGL Mutations, a Donor Splice Site Mutation of Chinese Origin and a 1-bp Deletion of Japanese Origin."Am.J.Med.Genet.. 93. 211-214 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Takahashi, K., Akanuma, J., Matsubara, Y., Fujii, K., Kure, S., Suzuki, Y., Wataya, K., Sakamoto, O., Aoki, Y., Ogasawara, M., Ohura, T., Miyabayashi, S., Narisawa, K.: "Heterogeneous mutation in the glucose-6-phospatase gene in Japanese patients with glycogen storage disease type 1a."Am.J.Med.Genet.. 92. 90-94 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yang X, Aoki Y, Li X, Sakamoto O, Masahiro H, Gibson KM, Kure, Narisawa K, Matsubara Y, Suzuki Y.: "Haplotype analysis suggests that the two predominant mutations in Japanese patients with holocarboxylase synthetase deficiency are founder mutations."J.Hum.Genet.. 45. 358-362 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Suzuki, Y., Lanner, C., Chen Bi, Hong Zhang, Cooper, L.D., Melissa M., Bowker-Kinley, DePaoli-Roach, A.: "A.Gene structure and expression of the targeting subunit, RGL, of the muscle-specific glycogen-associated type 1 protein phosphatase, PP1G."Archiv.Biochem.Biophys.. (in press). (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Suzuki, Y., Lanner, C., Kim, J.-H., Vilardo, P.G., Zhang, H., Yang, J., Cooper, L., Steele, M., Kennedy, A., Scrimgeour, A.Lawrence Jr., J., C., DePaoli-Roach, A.A.: "Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL."Mol.Cell.Biol.. (in press). (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yang X et al.: "Haplotype analysis suggest that the two predominant mutations in Japanese patients with holocarboxylase synthetase deficiency are founder mutations."J.Hum.Genet.. 45;6. 358-362 (2000)
• [文献書誌] Sakamoto O et al.: "Diagnosis and mutation analysis of an atypical case of holocarboxylase synthetase deficiency"Europian Journal of Pediatrics. 159;1-1. 18-22 (2000)
• [文献書誌] Aoki Y. et al.: "Identification and characterization of mutations inpatients with holocarboxylase synthetase deficiency"Human Genetics. 104,2. 143-148 (1999)
• [文献書誌] Hou D. et al.: "Glycogen storage disease type Ib: structural and mutation analysis of the microsomal glucose-6-phosphate transporter gene"American Journal of Human Genetics. 86,3. 254-257 (1999)
• [文献書誌] Sakamoto O. et al.: "Relationship between kinetic properties of mutant enzymes and biochemical and clinical responsiveness to biotin in holocarboxylase synthetase deficiency"Pediatric Research. 46,6. 671-676 (1999)
• [文献書誌] Sakamoto O. et al.: "Diagnosis and mutation analysis of an atypical case of holocarboxylase synthetase deficiency"Europian Journal of Pediatrics. 159,1-2. 18-22 (2000)
• [文献書誌] Fujii K. et al.: "Mutation detection by TaqMan-allele specific amplification: Application to molecular diagnosis of glycogen storage disease type Ia and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency"Human Mutation. 15,2. 189-196 (2000)
• [文献書誌] 鈴木洋一 (共著): "生体の科学"金原出版. 512 (1999)