| 研究課題/領域番号 |
11660081
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
田原 康孝 静岡大学, 農学部, 教授 (30022320)
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| 研究分担者 |
徳山 真治 静岡大学, 農学部, 助教授 (60283347)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2000年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1999年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | Bacillus subtilis / 納豆菌 / γ-ポリグルタミン酸シンテターゼ / 遺伝子破壊 / ywsC-ywtABC遺伝子 / γ-ポリグルタミン酸 / γ-ポリグルタミン酸合成遺伝子 / グルタミン酸合成酵素 / 相同組換え |
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| 研究概要 |
納豆菌(Bacillus subtilis IFO16449)のγ-ポリグルタミン酸(PGA)の生合成に関与する遺伝子をクローニングした。クローン化したDNA断片(4.2Kb)に、B.subtilis 168で報告されているywsC、ywtABCとほぼ同一の塩基配列を示す4つの遺伝子を同定し、これらの遺伝子がPGA合成に関与する遺伝子であることは、このDNA断片を形質転換した大腸菌(E.coli JM109)がPGAを生産したことによって確かめられた。納豆菌NR-1のこれら4つの遺伝子(ywsC-ywtABC)の機能を明らかにするために、ywsC、ywtA、ywtBの3つの遺伝子破壊株を作製した。ywsCとywtAの2つの遺伝子破壊株はPGAをまったく合成しなかったが、ywtB遺伝子破壊株は少量のPGAを合成した。これらの結果から、納豆菌NR-1のPGA合成には少なくともywsCとywtAの2つの遺伝子が必要であり、ywtC遺伝子はPGAの大量生産に関わる遺伝子であることが示された。
ywsC遺伝子(1182bp)とその上流約1Kbを含むDNA断片の下流に、ywsC遺伝子のC末端にヒスタグコドンを付与した断片(300bp)とPGAオペロンの転写終結配列を含む断片(150bp)のPCR増幅物を連結させ、これをpHY300PLKベクターに挿入し、この組換えプラスミドを納豆菌のywsC遺伝子破壊株に形質転換した。形質転換株にヒスタグ抗体でYwsCタンパク質(分子量44K)の生産とPGA合成を確認したのち、菌体破壊液からニッケルアフィニテイークロマトによってYwsCタンパク質を精製した。精製タンパク質を^<14>C-L-グルタミン酸、ATP、マンガンイオンを含む反応液に加えて反応させ、^<14>C-PGAを反応生成物として検出した。この結果は、YwsCタンパク質がL-あるいはD-グルタミン酸をγ-グルタミル結合させてPGAを合成するPGAシンテターゼであることを強く示唆している。
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