| 研究課題/領域番号 |
11660088
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
榊 利之 京都大学, 農学研究科, 助教授 (70293909)
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| 研究分担者 |
加藤 茂明 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (60204468)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1999年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | ビタミンD / シトクロームP450 / 部位特異的変異 / 水酸化酵素 |
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| 研究概要 |
(1)ヒト由来ビタミンD_31α位水酸化酵素(CYP27B1)の構造と機能の解析
ヒト由来CYP27B1の正常型、くる病患者由来変異型9種および部位特異的により得た種々の変異型CYP27B1を大腸菌で発現させ、酵素化学的性質を調べた。さらに、CYP27A1においても同様の変異体を作製し、詳細な分光学的解析を行った結果、くる病患者由来変異型9種の変異箇所のアミノ酸残基の役割を解明することができた。また、菌体におけるCYP27B1活性を上昇させるためにアドレノドキシンおよびNADPH-アドレノドキシン還元酵素との同時発現を試み、活性を著しく上昇させることに成功した。この同時発現株は1α,25-ジヒドロキシビタミンD_3生産に応用できる可能性がある。
(2)ヒト由来ビタミンD_324位水酸化酵素(CYP24)の酵素化学的性質
ヒト由来CYP24を大腸菌で発現させ、25-ヒドロキシビタミンD_3を基質として代謝産物を分析した結果、24位水酸化に始まる代謝産物4種と23位水酸化に始まる代謝産物4種が検出された。23-代謝経路はラットでは全く見られず、明らかな種差が認められた。本酵素を含む膜画分および菌体は医薬用ビタミンD_3類縁化合物のヒト体内における代謝を予測するシステムとして有用である。
(3)ヒト由来ビタミンD_325位水酸化酵素(CYP27A1)の構造と機能の解析
CYP27A1を大腸菌内で大量発現させ、ビタミンD_3に対する代謝を調べたところ、主要代謝産物である25-ヒドロキシビタミンD_3を含めて8種類の代謝産物が検出された。種々の代謝実験からCYP27A1によるビタミンD_3代謝経路を明らかにし、速度論的解析により、それぞれの反応の生理的意義を推測した。
(4)ヒト体内におけるビタミンD_3および医薬用ビタミンD_3類縁化合物の代謝
ヒト由来CYP27B1、CYP24およびCYP27A1の代謝経路を総合することにより、ヒト体内で検出される30種を超えるビタミンD_3代謝物のほとんどが、これら3種のP450による代謝の組み合わせにより説明できることがわかった。本研究で確立した3種のP450の発現系は種々のビタミンD_3代謝物の生産に応用でき、また、医薬用ビタミンD_3類縁化合物のヒト体内における代謝を予測するシステムとして有用である。
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