| 研究課題/領域番号 |
11660097
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 工学院大学 |
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研究代表者 |
太田 隆久 工学院大学, 工学部, 教授 (30011844)
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| 研究分担者 |
坂口 政吉 工学院大学, 工学部, 助手 (80281351)
菅原 康里 工学院大学, 工学部, 講師 (20133324)
大勝 靖一 工学院大学, 工学部, 教授 (20011009)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2000年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1999年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
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| キーワード | L-乳酸脱水素酵素 / 酵素による有機合成 / 基質特異性 / 活性部位 / 部位特異的変異 / ビスィズス菌 / バイオリアクター / タンパク質分解酵素 |
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| 研究概要 |
L-乳酸脱水素酵素(LDH)は細胞内でピルビン酸をNADHにより還元して立体選択的にL-乳酸を生じる反応を触媒する。大腸菌にクローニングされたBifidobacterium longumと高度好熱菌Thermus aquaticus YT-1およびT.caldophilus GK-24のLDHの基質特性を調べ、B.longumのLDHがピルビン酸に対して特異性が高く、この基質のメチル基が他のアルキル基に置換している基質への触媒活性が低いこと、Thermus LDHは前者のLDHより長鎖2-ケト酸に対する活性が高いことを確かめた。
次に、既に結晶解析により立体構造の明らかにされているB.longum LDHの基質結合部位に関係するアミノ酸残基をタンパク質モデリングプログラムを用いたコンピュータシュミレーションにより特定し、これらアミノ酸残基を組換えDNA技術を用いて置換した各種変異酵素を作成した。ピルビン酸および各種長鎖2-ケト酸に対するこれら酵素の活性を測定した。酵素の総合的活性指数としては触媒活性と親和性パラメーターの積であるK_<cat>/S_<0.5>を用いた2-ケトカプロン酸に対する活性を比較すると野生型酵素に較べて100ないし500倍高い活性を持つ変異酵素をえることが出来た。
各種2-ケト酸の水に対する溶解度が低いため、有機溶媒での反応が可能なようにB.longum LDHを脂質修飾して有機溶媒に可溶化することを試みたが、この酵素の分子量が大きいことなどの理由で成功できなかった。そこで水と混和性のある各種有機溶媒中でのLDHの活性を調べたところ、有機溶媒の濃度を高めると活性が低下する場合もあるが、逆に数倍に増加することもあることを見出し、有機溶媒中での反応触媒が可能であることを示した。
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