| 研究課題/領域番号 |
11670102
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
薬理学一般
|
|---|
| 研究機関 | 昭和大学 |
|---|
研究代表者 |
小山田 英人 昭和大学, 医学部, 助手 (50266160)
|
|---|
| 研究分担者 |
小口 勝司 昭和大学, 医学部, 教授 (50129821)
木内 祐二 昭和大学, 薬学部, 教授 (50204821)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
|
| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2000年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1999年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
|
|---|
| キーワード | カルシウムイオン / カルシウム放出チャンネル / Tet On-Off / リアノジン受容体 / 悪性高熱症 |
|---|
| 研究概要 |
(1)テトラサイクリン制御性トランス作用因子(tTA)を恒常的に発現しているCHO細胞を獲得し、一方に緑色蛍光蛋白質(GFP)のcDNAを、他方にウサギ骨格筋より得られたカルシウム放出チャンネルであるリアノジン受容体(RyR1)をコードするcDNAを挿入したpTRE発現ベクター(テトラサイクリンオペレーター配列の後側にminiサイトメガロウイルスプロモーターを持っているプラスミドベクター)を遺伝子導入した。これらのCHO細胞においてRyR1発現の分布と量を抗RyR1抗体によって調べたところ、GFP蛍光を発している細胞においてのみ、その細胞質に点在するRyR1の発現が確認できた。
(2)日本人の悪性高熱症(malignant hyperthermia、MH)の患者において、新たなRYR1遺伝子変異を発見した。以前に作製/改良した「カセット構造化」したRYR1cDNAを用いて、人為的にこのMH遺伝子変異体を作製し、上記のpTREベクターに挿入してCHO細胞に遺伝子導入して強制発現された。このMH変異体のカルシウム放出機能において、明らかなカフェイン感受性の増加がみられた。また、既知のMHのRYR1変異体と比較するために、GFP蛍光強度を指標として発現量のほぼ等しいCHO細胞を選択して解析を行ったところ、両MH変異体ともに同様な薬物感受性の増加を呈するものであることが判った。
(3)これらのGFP/RyR1発現は、テトラサイクリン類似体ドキシサイクリン(Dox)の添加により完全に抑制されたので、Doxの有無による発現のOn-Off制御が可能であることが判った。
以上のように、テトラサイクリン制御性遺伝子発現システムを用いることによって、GFPなどのレポーター産物を指標としながら、目的遺伝子産物の発現量を比較/制御して、その機能解析が可能となった。
|
