| 研究課題/領域番号 |
11670275
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
良原 栄策 東海大学, 医学部, 助教授 (70167063)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2000年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1999年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 緑膿菌 / 多剤耐性 / 薬剤排出ポンプ / OprM / チャンネル / α-ヘリックス / 膜トポロジー / マルトポーリン / トポロジー決定法 / tolC |
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| 研究概要 |
緑膿菌は日和見感染症の主要起因菌で、高度な多剤耐性を示す病原細菌である。この多剤耐性は薬剤排出ポンプの働きによることが明らかにされている。緑膿菌の主要な排出ポンプであるMexAB-OprMの外膜成分であるOprMの分子機能の解明に取りくんだ。まずOprMを外膜から精製し、リポソーム膜に再構成しその活性を調べた。その結果OprMはゲート機能をもつチャンネルタンパクであることが明らかとなった。さらにもう二種あるポンプ系で外膜成分を構成するOprJとOprNも同様に調べたところ、両者ともやはりチャンネルタンパクであることが示された。外膜でチャンネルを形成するタンパクとしてポーリンが良く知られている。ポーリンはβバレル構造をとって孔を形成しているので、OprMも似た構造をとると予想し、CD測定しその二次構造を調べた。驚いたことにOprMはおもにα-ヘリックスからなるタンパクであることがわかった。OprJやOprNもやはり同様にα-ヘリックスが豊富なタンパクであることが示された。次にこのようなユニークな構造をもつOprMチャンネルの膜トポロジーの解明が必要とされた。なぜならOprMチャンネルの孔開閉制御やMexABとのタンパク間相互作用を明らかにするには膜トポロジーの知見が必要である。ところが外膜タンパクのトポロジーを決める従来の方法では、トポロジーの全体像を知るには不充分である。そこで膜タンパクのトポロジーを決定する新たな方法の開発に取りくんだ。考案した方法は、従来のin vivo法と異なり、再構成系を用いたin vitro法である。この方法の最大の特徴は、原理的にいかなる膜タンパクにも適用できる点にある。従ってこれまで膜トポロジーを決めるのが困難であった細胞内小器官の膜タンパクにも適用することができる。この方法ではまず目的とする膜タンパクの様々な部位にCys残基を導入し、そのタンパクをリポソームに再構成する。導入したCys残基が細胞外ループにあれば化学標識される。次にプロテアーゼで処理した時、細胞外ループが切断されれば、分解産物が標識されることになる。一方細胞内ループにCys残基が導入された場合は、非分解産物が標識されるはずである。この方法を立体構造が明らかにされているマルトポーリンに適用した。その結果、今回の方法が膜トポロジーを決める方法として有効であることが明らかとなった。
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