| 研究課題/領域番号 |
11670300
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
ウイルス学
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
河野 友子 長崎大学, 大学院・医学研究科, 助手 (60284684)
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| 研究分担者 |
松山 俊文 長崎大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30165922)
山本 一男 長崎大学, 大学院・医学研究科, 講師 (70255123)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2000年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1999年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | IRF-3 / IFNβ / dsRNA / NDV / GFP融合タンパク質 / HT1080 / 発現スクリーニング / in vitroリン酸化アッセイ |
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| 研究概要 |
インターフェロン制御因子-3(IRP-3)は様々な細胞の細胞質に存在しており、ウイルスや細菌の感染によりC末端領域に存在するセリン・スレオニン残基がリン酸化されて核に移行し、CBP/p300と会合することによりインターフェロンβ(IFNβ)の発現を誘導する。しかし、このIRF-3の活性化に重要な役割を果たしているタンパク質キナーゼの本体については現在のところ全く判っていない。本研究は、このIRF-3キナーゼの同定を中心に、RF-3活性化の細胞内情報伝達機構の解析を目的とする。
発現スクリーニングを行う目的で、IFNβプロモーターの下流にH-2K^kまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだレポータープラスミドによるHeLa細胞の安定形質転換細胞株を樹立した。これらの細胞株にdsRNAを加えると、いずれのレポーターでも活性の上昇が認められた。しかしながらdsRNA添加後の細胞傷害のため、スクリーニングには不適当であることが判明した。そこで、レポーター遺伝子の活性化に先んじて起こると考えられるIRF-3の核内移行に着目し、アッセイシステムを構築することにした。このためにまず、GFPとIRF-3の融合タンパク質(GFP-IRF3)を細胞に発現させ、dsRNAやLPSの添加、あるいはニューキャッスル病ウイルス(NDV)の感染によるGFP-IRF3の細胞内局在の変化を調べた。HeLa細胞を用いた場合、どの刺激を加えてもGFP-IRF3は細胞質に留まり、顕著な核内移行を示さないことが分かった。そこで、U937、THP-1、COS7、およびHT1080などの細胞について検討したところ、HT1080についてのみ、NDV感染またはdsRNA添加に依存してGFP-IRF3が核内に移行することを確認した。この現象は、刺激後30分から起こり、少なくとも10時間後まで持続することが分かった。24時間後まで観察を続けた結果、NDV感染の場合にはほとんどの細胞が死滅したのに対し、dsRNA添加では特に死細胞の増加は認められなかった。従って、HT1080細胞のGFP-IRF3安定形質転換株を用いることにより、dsRNA刺激に依存したGFP-IRF3の細胞内局在変化を指標にして情報伝達因子をスクリーニングすることができると考えられる。
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