| 研究概要 |
PCNAは,DNAポリメラーゼδ(pol δ)のprocessive DNA合成の補助因子であり,真核細胞のDNA複製,および,ヌクレオチド除去修復に必須のタンパク質である.さらには,p21,GADD45,FEN-1,CAF-1,Dnmt1等に結合することが報告され,DNA上で起こる各種反応の制御機構に重要な役割を果たしていると考えられている.このPCNAが関与するDNA修復の分子機構の解明を目的として,組換え型ヒトPCNA変換体およびFEN-1変換体を用いて,その直接の相互作用を調べた.2本鎖から1本鎖が枝分かれしたブランチ構造を持つDNA(5'flap DNA)をテンプレートとして,PCNAとFEN-1直接相互作用をGel Mobility Shift アッセイおよびDNase Iフットプリンティング実験により解析した.その結果,Gel Mobility Shift アッセイでは,PCNAの存在によりFEN-1はDNA上に安定に存在できることが分かった.また,DNaseIフットプリンティング実験により,PCNAは5'flap DNAの5'側から相互作用している可能性が示唆された.さらに,PCNAの21番目のアスパラギン酸をグルタミン酸,アスパラギンまたはアラニンに置換したPCNA変換体を用い,5'flapDNAを基質として,FEN-1のヌクレアーゼ活性を解析したところ・グルタミン酸変異体では野生型同等の活性促進効果がみられたものの,アスパラギンならびにアラニン変異体では野生型の10〜30%の活性促進効果しか見られなかった.この結果から,FEN-1のエンドヌクレアーゼ活性促進にはPCNAの21番目のアスパラギン酸の持つ負電荷が重要である可能性が示唆された.
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