| 研究課題/領域番号 |
11680617
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
藤田 信之 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助手 (90173434)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2001年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1999年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | RNAポリメラーゼ / 転写 / σ因子 / 蛋白質-蛋白質相互作用 / 蛋白質-DNA相互作用 / 大腸菌 |
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| 研究概要 |
大腸菌における主要σ因子であるσ70、終止期特異的に働くσ38、窒素代謝関連遺伝子の発現に働くσ54の3種のσ因子を対象に、分子上の様々な位置に1個のみシステイン残基を持つ変異体をそれぞれ12種類、9種類、5種類作成した。システィン特異的な修飾反応を使って、これらのσ変異体のそれぞれにペプチド鎖・ヌクレオチド鎖切断活性を持つ鉄・EDTA誘導体を導入した。ホロ酵素を再構成したのち、切断反応を行なって、RNAポリメラーゼのβ、β'サブユニット上の切断位置を同定した。また、DNAを加えて転写開始複合体を形成させたのちに切断反応を行ない、鋳型DNAの切断位置を調べた。その結果から、3種類のσ因子がコア酵素上のほぼ同一の領域と接触していること、転写開始複合体中でのσ因子の配向が互いによく似ていることが示された。
β'サブユニットの種々の領域を含むフラグメントを調製し、in vitroでのσ70との結合を調べた結果、保存領域Bを含む201から345までの領域が、量も強い結合活性を示した。この結果は鉄・EDTA誘導体を用いた上の結果ともよく一致しており、この領域が主なσ因子結合部位であると結論された。
σ70の保存領域のうち機能がわかっていない4.1領域に注目し、保存性の高いアミノ酸をAlaに置換した変異体11種を作成して、in vitro転写およびDNaseIフットプリンティングによる解析を行なった。その結果、4.1領域はプロモーターの認識に直接関わってはいないものの、4.1領域上のいくつかのアミノ酸残基が、恐らくはコア酵素との相互作用を介して、σの4.2領域とプロモーターの-35配列との正確な配向を決めるのに重要な役割を果たしていることが示唆された。
大腸菌のそれぞれのσ因子の細胞内での存在量と増殖相による変動を測定した。またin vitroでそれぞれのσ因子のコア酵素への結合活性を測定した。これらのデータからそれぞれのホロ酵素の細胞内での存在量を推定するこくとができた。また、いくつかのσ因子の組み合わせについて、それぞれの濃度およびコア酵素への親和性を反映して実際にσ因子の交換が起こることをin vitroで示した。
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