| 研究概要 |
1.組み換え体ラットメチオニン合成酵素(MS)の発現と精製および性質。
ラットMS cDNAをバキュロウイルス-昆虫細胞の発現系で発現させた。MSはほとんどがアポ酵素で発現したので,メチルB_<12>でホロ化して安定化した後,カラムクロマトグラフィーにより精製した。最高比活性や基質のK_m値はラット肝臓の精製酵素と良く一致した。精製MSはcob(II)alamin様の吸収スペクトルを示したが,titanium(III)およびS-アデノシルメチオニンの共存で本来の補酵素であるメチルB_<12>様のスペクトルに変化した。また,還元剤の強さに依存した酸化的失活反応の抑制が確認された。B_<12>の下方配位子部の塩基部やホスホジエステル結合領域がアポ酵素への結合やMS活性発現に重要であることや,シアノB_<12>やアクアB_<12>,アデノシルB_<12>がアポ酵素との複合体形成能が非常に低いことなども示された。
2.ラット組織中のB_<12>レベルの変動と酵素活性調節機構の解析
妊娠・授乳の期間中親ラットをB_<12>欠乏飼料で飼育して生れた雄ラットを,離乳後B_<12>欠乏飼料で飼育し,B_<12>欠乏ラットを得た.対照群には毎日1μgのシアノB_<12>を経口投与した.B_<12>欠乏群には,体重増加量の低下,尿中メチルマロン酸量の顕著な増加,肝臓中のB_<12>量やホロMS活性,全MS活性,MSタンパク質量の顕著な減少が認められた.B_<12>欠乏ラットにメチルB_<12>を投与すると,比較的短時間でのB_<12>欠乏状態からの回復と,MS活性やMSタンパク質量の経時的に増加が認められた.しかしながら,どの群でもMS mRNA量が同程度だったことと,MSのほとんどがB_<12>を結合したホロ酵素であること,アポMSが不安定であることより,B_<12>の欠乏に伴うMS活性の著しい低下はMSが補酵素による安定化を受けられないためであると結論した.
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