| 研究課題/領域番号 |
11680647
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | (財)東京都医学研究機構 |
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研究代表者 |
斉藤 修 財団法人東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 主事研究員 (60241262)
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| 研究分担者 |
小田桐 恵 財団法人東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 主事研究員 (10260308)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2000年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1999年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | Gタンパク / RGS / 脱感作 / カリウムチャネル / 受容体 / 伝達物質 / 脳 / 神経 |
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| 研究概要 |
本研究では、Gタンパク応答のアクセルパターンがRGSタンパクのどの部位が決めているかを調べていくため、まずRGS8のN末配列に注目した。RGS8には、RGSドメインに加え、特徴的な35アミノ酸からなるN末配列が存在する。このRGS8のN端配列にどのような機能があるか検討した。
1、長いN端を持ちRGS8の特徴的なN端配列をもたないRGS7が、Gタンパク応答をどう制御するか、Gタンパク制御型内向き整流性K^+チャネル(GIRK)系を用いて、検討した。RGS7は、RGS8と異なり、Gタンパク応答のオン過程は顕著に加速したが、オフ過程の加速能力は低かった。またRGS8が示す伝達物質存在下での脱感作は、RGS7は、引き起こせなかった。これらのことから、N端配列が加速パターン決定に重要であることが強く示唆された。
2、RGS8がGタンパク共役反応であるイーストのフェロモン応答を脱感作できるか、またRGS8のN末配列がその脱感作能に関与しているか、全長RGS8とN末35アミノ酸を欠失したRGS8を発現させて検討した。その結果、RGS8にはフェロモン応答の脱感作能があること、さらにRGS8はそのN末を失うと、明らかに脱感作の効率が低下することが判明した。しかし、生化学的実験では、N末欠失RGS8もGαに十分結合することが明らかになった。その為、RGS8のN末配列には生体内で効率的に作用する際に重要な何らかの機能が隠れていることが示唆された。
3、GIRK系を用いて、N末欠失がRGS8の生理作用をどう変化させるか、検討した。その結果、オン・オフの加速については、差違が見られないが、リガンド存在下での脱感作は、N末欠失によって大きく減少することが明らかになった。そこで、次にこのRGS8N末配列が、どの様な機構に関わってGタンパク応答を制御しているのか、一つの可能性として、細胞内分布制御との関連を想定した。
4、まずRGS8に特異的な抗体を作成した。次に培養細胞に、RGS8とN末35残基を欠いたΔNRGS8を発現させた。そして、細胞から細胞質画分・膜画分を調製し、抗RGS8抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。その結果、RGS8は膜画分に、ΔNRGS8は細胞質画分に検出され、N端領域が細胞内分布支配に重要であることが判明した。
5、RGS8をGFPとの融合タンパクとして培養細胞に発現させ、その細胞内分布を観察した。その結果、RGS8は主に核に濃縮していた。さらに、活性型変異体のGαοを共発現させGタンパク刺激を行うと、RGS8が核から細胞膜表面の突起状の構造に移動することが判明し、極めてダイナミックな動きを示すことが明らかになった。そこでさらにこのRGS8の核内分布・細胞膜移行に、RGS8のN端配列が如何に関わっているか検討した。結果、非刺激時の核内分布、さらに細胞膜へのトランスロケーションに、そのN端配列が必要であることが判明した。
以上の解析から、「RGS8はそのN端配列によってその細胞内分布がダイナミックに支配され、それによってRGS8の生理作用であるGタンパク応答加速が制御されている」という全く新しい知見を得ることに成功した。
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