| 研究概要 |
DNAポリメラーゼε(Polε)は真核細胞のDNA複製におけるDNA鎖伸長そのものに関与することに加えて、ポリメラーゼ活性とは別の細胞増殖に必須の未知の機能を持つことや、S期チェックポイント制御機構での複製フォーク進行阻害のセンサーとしての役割を担うこと、さらには複製開始にも関与することが報告されている。本研究では、これらの重要な生理学的役割をPolεがどのような分子機構により果たしているのかを解明することを目的として、出芽酵母Polεの構造と機能について生化学的解析を行い、以下の新たな知見を得た。
1.Pol2C-末ドメインおよびアクセサリーサブユニットDpb2,Dpb3,Dpb4の生化学的機能
(1)PCNAに依存したPolεのDNA合成反応:4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)から成るPolεは、高塩濃度下でPCNAに依存したDNA合成を行うことが知られているが、これに対してPol2のポリメラーゼドメイン(C-末領域を欠く)のみではDNA合成活性は保持されているものの、PCNA依存性が非常に低いことを明らかにした。さらにこのPCNA依存性にDpb2が関わることを示唆する結果を得た。
(2)PolεのDNA結合能:Polε複合体およびPol2のポリメラーゼドメインのDNA結合能をゲルシフト法を用いて解析した。その結果、Pol2C-末領域および(あるいは)アクセサリーサブユニットに依存する二本鎖DNA結合能を見出した。このDNA結合はDNA合成反応とは競合しない。
2.Polεの個々のサブユニットの発現と精製
細胞増殖に必須であるアクセサリーサブユニット、Dpb2をカイコ体内で発現させ、この精製を完了した。Dpb3、Dpb4についてもこれらをカイコ体内で発現させることに成功したが、Pol2については成功するに至らなかった。
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