| 研究課題/領域番号 |
11680682
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
分子生物学
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| 研究機関 | 京都大学 (2000)
熊本大学 (1999) |
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研究代表者 |
山添 光芳 京都大学, 医学研究科, 助手 (00284745)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2000年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
1999年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | 大腸菌 / 染色体分配 / MukFEB蛋白複合体 / SeqA蛋白 / DNAメチル化 / Smc蛋白 |
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| 研究概要 |
1.MukFEB蛋白複合体の同定と精製
MukF、MukE蛋白はMukB蛋白のC末球状ドメインに結合して600kDの複合体を形成していた。MukFEB複合体はDNAのメチル化状態に関係なく一本鎖DNAと二本鎖DNAに同じ強さで結合した。またATP加水分解能はDNAに依存しなかった。
MukFEB複合体とMukBの電子顕微鏡による形態観察を行った。MukFEB複合体はMukB単独に比べ明らかに両方の球状ドメインが大きく、MukB部分の球状ドメインを介する高次構造も観察された。
2.SeqA蛋白の細胞内局在
SeqA蛋白は複製直後の半メチル化GATC配列に特異的に結合し、細胞内で数個のクラスターを形成する。細胞周期を同調した細胞で、SeqAクラスターの動きを詳細に観察した。DNA複製開始直後にSeqAクラスターは細胞の中央に1個出現し、その後2個になって、DNA複製が終了する前に反対方向に分離した。また染色体複製開始領域(oriC)は細胞中央で2個になり、しばらく対をなして存在することがわかった。
3.MukB蛋白の細胞内局在
MukBはMukF、MukEがともに存在する時に、SeqAと同じように細胞内で数個のクラスターとして局在した。しかし新生細胞ではSeqAクラスターが細胞中央に1個存在するのとは対照的にMukBクラスターほ細胞の1/4、3/4長の位置に1個ずつ存在していた。その後SeqAクラスターは2つになり、それぞれMukBクラスターの近くに移動した。
4.SeqA蛋白に結合するDNA領域の同定
細胞周期を同調した大腸菌をin vivoで蛋白とDNAのクロスリンクをかけ、SeqA抗体で免疫沈降しSeqAに結合しているDNA領域を同定した。複製フォークの進行に伴い複製開始領域(oriC)から複製終結領域(ter)に向かってSeqAの結合部位が次々と移動していくのが観察できた。
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