| 研究概要 |
活性化PKCの伝達物質放出増強の分子機構を明らかにするため、活性化PKCの細胞内受容体であるRACK1の役割に注目し,副腎髄質クロマフィン細胞を用いて実験を行い、以下の結果を得た。
1)免疫組織化学実験:RACK1は主に細胞膜直下に局在しており,F-actinと同じ局在を示した。クロマフィン細胞にはPKC α,β,ε,ζ,が存在しており,静止時には細胞質に局在しているが、TPAによりPKCを活性化させた細胞ではRACK1結合部位であるC2領域を持つPKCα,βだけが細胞膜直下へ移行し,RACK1と同じ局在を示した。MicalolideB(MLB)処理により、細胞内F-actmをmonomerに解離させた場合,RACK1の消失が観察され,PKCα,βの移行が見られなかった.一方,F-actinを短いfilamentに切断するCytochalasinD(CD)処理細胞では,RACK1は細胞膜直下に局在し,PKCα,βの移行が観察された。
2)免疫沈降実験:抗RACK1抗体による免疫沈降実験では,control細胞ではRACK1とともにactinが共沈し,TPA処理細胞では加えてPKCα,βが共沈した.またRACK1が局在するThton-insoluble fractionをMLB処理した場合,actinとRACK1が共に遊離することから,RACK1がF-actinと結合していることがわかった。
3)分泌測定実験:活性化PKCは開口放出におけるプライミング過程を増強しており、この増強作用はPKCα,βの活性化が担っていることを特異的阻害剤,活性化剤を用いて明らかにした。また,MLBはTPAによる分泌増強作用を阻害し,一方,CDは影響を及ぼさなかった。以上の結果より,活性化PKCはRACK1を介したF-actinへの結合により、開口放出のプライミング過程を増強していることが明らかとなった。
4)共焦点レーザー蛍光顕微鏡および冷却型CCDカメラシステムを用いて、蛍光ラベルにより可視化した分泌顆粒の動態の実画像解析を行った結果、分泌顆粒を放出部位へ移動、供給の過程にPKCおよびF-actinが関与していることが示された。これらの結果より、プライミング過程とは、分泌応答持続また操り返し応答するために分泌顆粒を放出部位へ移動、供給、準備する過程であることが示唆された。
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