| 研究概要 |
外有毛細胞が有する,電気刺激に対応し自ら伸縮するというユニークな機能は,細胞側壁の表面層に存在するタンパク質モータの変形により生じるものと推察されているが,その機序は未だ明らかとなっていない.そこで我々は2年前,まずモルモットのタンパク質モータの同定の作業に取りかかった.モルモット蝸牛からコルチ器を採取し,cDNAライブラリーを作製した.そして,各クーロンの塩基配列決定後,データベースを用いた解析および組織での発現状態を調査することにより,タンパク質モータ遺伝子の同定を試みた.その結果,蝸牛で重要な働きを担っていると考えられる2つの遺伝子を発見した.しかし,残念なことに,2000年P.DallosグループがGerbilのそれの同定に成功し,タンパク質モータのgeneは"Prestin"と命名された.(Nature 405:149-155,2000)そこで,我々は研究方針を変え,公開されたprestinの塩基配列を基に,PCR法を応用し,砂ねずみ蝸牛からprestinのcDNAをクローニングすることを試みた.その結果,以下のことが明らかとなった.
1.Prestinの塩基配列がPCR法で増幅可能な配列長を超える長さであったため,prestinを4分割し,クローニングした.その後,得られた4つのprestin断片を,PCR法を応用してつなぎ合わせた結果,完全長のprestin cDNAをクローニングすることができた.
2.長い塩基配列を有するcDNAをクローニングする場合,本研究で用いられたPCR法を応用した手法は有用であった.その際,各断片の接合部位において誤った配列を増幅しないために,クローニングにおいて,反応温度,時間等の実験条件を熟考する必要があると考えられた.
|
