同化型硝酸還元酵素遺伝子発現に関与する転写調節因子の同定とクローニング

• 研究課題/領域番号: 11760047
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 植物栄養学・土壌学
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 白石 斉聖 神戸大学, 農学部, 助手 (00304121)
• 研究期間 (年度): 1999 – 2000
• 研究課題ステータス: 完了 (2000年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 2000年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円); 1999年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 硝酸還元酵素 / シスエレメント / DNA結合タンパク質 / cDNAクローニング

研究概要

1,NRゲノム遺伝子上のcis-acting DNA elementの解析
ホウレンソウNRゲノム遺伝子上の"AGCTA"配列について、硝酸イオンによるNR誘導に必要な"AGCTA"配列は-261〜-265の領域(NR-2)であることを同定した。またこの領域の直前にあるAT Rich領域も遺伝子発現に不可欠であることを明らかとした。
2,硝酸誘導に関与するDNA結合タンパク質の検索
NR-2領域の"AGCTA"配列に特異的に結合するDNA結合タンパク質の存在を明らかとした。
3,DNA結合タンパク質のcDNAクローニング
2で述べたDNA結合タンパク質のcDNAクローニングを行った。酵母One-hybrid法を用いて約30万個の組換え体から10個のポジティブクローンを得た。得られたクローンについて塩基配列を決定し、データベース検索を行った。ホモロジー検索の結果、既知のDNA結合タンパク質は見られなかったが、1つのクローンが未知のタンパク質をコードしていることが明らかとなった。このクローンからタンパク質を発現させ、AGTCA配列を含むオリゴDNAを用いてゲルシフトアッセイを行った結果、このタンパク質がAGTCA配列を特異的に認識していることが明らかとなった。