新規微生物酵素アルドキシム脱水酵素を用いたニトリル合成

• 研究課題/領域番号: 11760074
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2001
• 研究課題ステータス: 完了 (2000年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 1999年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
• キーワード: aldoxime / dehydratase / Bacillus / Rhodococcus / screening / enzyme expression / nitrile / synthesis / acclimation / identification

研究概要

本年度の研究の概要としては、1)アルドキシム脱水酵素生産のための最適培養条件の確立、2)本酵素反応条件の最適化とニトリル合成への応用を行った。以下、その詳細について具体的に述べる。
1)本酵素生産のための最適培養条件の確立
前年度研究で得られた、各種アルドキシム脱水酵素生産株のうち、ピリジン-3-アルドキシム分解菌として分離されたRhodococcus sp.YH3-3株を用いて、培地条件、培養温度や通気量といった詳細な培養条件を検討し、本脱水酵素活性生産のための最適条件を設定した。また、本酵素が誘導酵素か否かを確かめるため、各種のアルドキシム、ニトリル化合物を別途化学合成して培地に添加し、本酵素生産に及ぼす影響を見た。この際用いた各種培地用及び合成用の試薬は本研究費で購入した。培養には振盪培養装置・恒温槽等の既存の装置を用いて行った。
2)本酵素反応条件の最適化とニトリル合成への応用
1)で得られた最適条件下で培養した本菌の休止菌体を用いたアルドキシムからのニトリル合成について、反応溶媒・温度・添加物等の効果を詳細に検討し、本反応の最適条件を確立するとともに、本酵素の有する未知の触媒作用を探索した。酵素反応を行う際に、各種の界面活性剤および有機溶媒の添加もしくは熱処理した菌体を用いることにより、ニトリルの収率を倍以上向上させることに成功した。最適化された条件下で、化学合成した各種のアルドキシムの脱水反応を行った。その結果、ピリジン-2-アルドキシム、ピラジンアルドキシム、2-フリルアルドキシム、n-ブチルアルドキシム等のアリールおよびアルキルアルドキシムを基質として、対応するニトリルをいずれも好収率で合成する事ができた。また化学合成した各種基質を用いて本酵素の基質特異性を検討し、得られた結果をもとに基質特異性の面から見た本酵素の反応メカニズムについて若干の考察を行った。酵素により合成したニトリル化合物の構造の確認は現有の各種分析機器等を用いて決定した。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A New Enzymatic Method of Stereoselective Oxidation of Racemic 1,2-Indandiols"Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic. (in press).
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "Occurrence of a Novel Lyase Catalyzing β-Elimination Reaction to ward threo-3-Chloro-L-aspartate in Pseudomonas putida TPU 7151"Bioscience Biotechnology and Biochemistry. (in press).
• [文献書誌] Y.Kato et al: "Distribution of Aldoxime Dehydratase in Microorganisms"Applied and Environmental Microbiology. 66. 2290-2296 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al: "Synthesis of Optically Active α-Monobenzoyl Glycerol by Asymmetric Transesterification of Glycerol"Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic. 9. 193-200 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al: "A Convenient Method of Preparing Optically Active N-Trityl-Aziridine-2-(S)-Carboxylate Esters from β-Halo-(S)-Amino Acids"Journal of Chemical Society Chemical Communications. 245-246 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al: "A Novel Heme-containing Lyase, Phenylacetaldoxime Dehydratase from Bacillus sp.strain OxB-1: Purification, Characterization, and Molecular Cloning of the Gene"Biochemistry. 39. 800-809 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "Synthesis of Optically Active α-Monobenzoyl Glycerol by Asymmetric Transesterification of Glycerol"Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic. (in press).
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Convenient Method of Preparing Optically Active N-Trityl-Aziridine-2-(S)-Carboxylate Esters from β-Halo-(S)-Amino Acides"Journal of Chemical Society Chemical Communications. 245-246 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Novel Heme-containing Lyase, Phenylacetaldoxime Dehydratase from Bacillus sp. strain OxB-1: Purification, Characterization, and Molecular Cloning of the Gene"Biochemistry. 39. 800-809 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Novel Method for Preparation of Optically Active α-Monobenzoyl Glycerol via Lipase-Catalyzed Asymmetric Transesterification of Glycerol"Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 9. 3207-3210 (1999)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "Nitrile Hydratase Involved in Aldoxime Metabolism from Rhodococcus sp. strain YH3-3-Purification and Characterization"European Journal of Biochemistry. 263. 662-670 (1999)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A New Enzymatic Method of Nitrile Synthesis by Rhodococcus sp. strain YH3-3"Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 6. 249-256 (1999)