| 研究課題/領域番号 |
11770283
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
竹内 義明 昭和大, 医学部, 助手 (20296982)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1999年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | ERKs / H^+K^+-ATPase / EGF |
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| 研究概要 |
Extracellular signal regulated protein kinases(以下ERKs)の胃壁細胞での酸分泌における役割を検討するにあたり、MDCK細胞を購入しDMEMにて培養した。この細胞では,外来的に導入されたHK ATPaseα subunit遺伝子のプロモーターがEGF刺激により活性化されることがすでに明らかにされている。はじめにEGF刺激によるERKs活性化を検討するため、同細胞を異なった時間、EGFで刺激した。cell lysateを作成し,抗リン酸化ERK抗体を用いたwestern blotにて活性化を検討したところ、20分刺激で最も強い活性が得られ、以後活性は時間と共に失われ時間依存性が確認された。同様に異なった濃度のEGFで刺激したところ、10nMで最も強い活性が得られ、濃度依存性も確認された。次にERK kinseであるMEK1の阻害剤PD98059を用いて、EGFによるERKs活性化の抑制効果を検討した。MDCK細胞を異なった濃度のPD98059でプレインキュベーションして、EGFで刺激したところ、30μMにて70〜80%の抑制効果が得られた。しかしながら10μMでも約50%の抑制効果は得られた。次にMDCK細胞にレポーターベクターを外来的にトランスフェクションすることを試みた。導入にはリポフェクション法を用いた。細胞数、プラスミドDNA量、リポフェクション試薬量の3因子の最適条件を決めるため、ルシフェラーゼのコントロールベクターを購入し、おのおの3因子の条件を変えて検討した。4μgのDNAと12μlのリポフェクション試薬が50000の細胞数に最適であった。今後は同細胞にHK ATPase α subunit遺伝子のプロモータ-組み込んだレポーターベクターを導入する予定である.
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