| 研究概要 |
レトロウイルスベクターであるLXSNは、そのなかにXと呼ばれる遺伝子を有し、その上流にクローニングサイトが位置している。クローニングサイトには、EcoRIと、HindIIIの酵素切断部位がある。そこで、HBVのcore領域とenvelope領域のそれぞれを含むプライマーを作成した。(HBV-c1:5'-AAGCTTATAAATTGGTCTGCGCACCAGCA,nt.1789-nt.1811,HBV-c2:
GAATTCTGTAGAGGAATAAAGCCCCGTAA,nt.2510-nt.2488,HBV-e1:5'-
AAGCTTGGTCACCATATTCTTGGGAACAA,nt.2821-nt.2843,HBV-e2:5'-
GAATTCCAATTCTTTGAGATACTTTCCAA,nt.1000-nt.978)この2組のプライマーには、それぞれの両端に、EcoRIとHindIIIの認識配列を付加してある。これらのプライマーを用いて、すでにクローニングしてある、HBV株(adwR9)をテンプレートとしてPCR反応を行い、その産物をアガロースゲルに流した後精製し、LXSNに組み込んだ。これによって、まずenvelopeだけ、あるいはcore蛋白だけを発現するコンストラクトを得た。次に、まず基礎実験として、in vitroで肝臓由来の細胞(HepG2,HuH7)に感染させ、ウイルス蛋白(coreとenvelope)の発現とその持続性について各々のコンストラクトについて調べた。蛋白の発現を、肝細胞内、培養上清の両者について調べたところ、HBcAg、HBsAgは、免疫組織染色で、肝細胞内にようせいに染色され、培養上清中にもEIA法にて検出された。経時的にこれらを調べると、HBcAg,HBsAgとも感染後2日目に肝細胞内で最高値となり、培養上清中では、3日目に最高値となった。現在、このコンストラクトをマウスに感染させる実験が進行中である。
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