| 研究課題/領域番号 |
11771406
|
|---|
| 研究種目 |
奨励研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
物理系薬学
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
宮内 正二 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (30202352)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1999年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
|
|---|
| キーワード | 高度好熱菌 / ABC輸送担体 / 多剤排出輸送担体 / 大量発現 / MDR / 膜蛋白 |
|---|
| 研究概要 |
基質の検討を行う目的で、大腸菌のpET systemにより、TmlpAおよびTmlpBの大腸菌における大量発現系の構築を試みた。これら蛋白は膜蛋白の10%発現していた。大腸菌膜蛋白のSDS電気泳動をPVDF膜にブロッティングし、N末アミノ酸シークエンスを行い、目的とする蛋白であることを確認している。この組み換え体蛋白は、dodecyl-maltosideには可溶化されず、pentadecafluorooctanoic acidに可溶化されることを見いだした。これら界面活性剤を組み合わせることにより、90%以上の部分精製が可能となった。また、native PAGEにより分離したTmlpはATPase活性を有していた。これより、これら界面活性剤用いてTmlpの活性を保持したまま膜から可溶化することが可能であることが明らかになった。更に、これら組み替え体にはHis Tag(ヒスチジン6個)付加してあり、Niカラムにより迅速に精製を行うことができるようにしてある。界面活性剤の組み合わせ可溶化及びNiカラム系を用いて、膜分画からの精製を試みる。精製後、リポソームへの再構成を行った。リポソーム再構成系を用いて、輸送基質の検索を行った。様々な脂溶性薬物(カチオン、アニオン、電気的中性)、水溶性薬物について検討したが、基質の同定にはいたらなかった。大腸菌での発現系では、活性を保持していない可能性も考えられる。そこで、高度好熱菌においての発現プラスミッドを用いて発現の構築を検討した。現在、その発現系を用いて、基質の同定を試みている。現在のところ、50種類の薬物を検討したが、どれも基質ではない結果となった。
|
