| 研究概要 |
PARPのcaspaseによる切断部位をgreen fluorescent protein(GFP)とblue fluorescent protein(BFP)の間のpeptide linkerとして発現するよう組み込んだベクターを構築した。peptide linker内のcaspase切断部位であるDEVDG(in PARP wt)にアミノ酸のDA置換を行い(in PARP mut)、これをcaspase insensitiveなネガティブコントロールとした。さらに、linker内、核局在化シグナル(NLS:nuclear localization siganal)にアミノ酸置換を行い、発現タンパクが細胞内でそれぞれ核(NLS wt)、および細胞質(NLS mut)に局在するようにベクターを構築した。大腸菌タンパク発現用としてpETPARP wt NLS wt,pETPARP wt NLS mut,pETPARP mut NLS wt,pETPARP mut NLS mut,哺乳動物発現用としてpcDNA3PARP wt NLS wt,pcDNA3PARP wt NLS mut,pcDNA3PARP mut NLS wt,pcDNA3PARP mut NLS mutをそれぞれ構築した。前者による、pET systemを用いたリコンビナントタンパクの発現は、予想される分子量(約70KDa)を、CBB染色ならびに、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。同様に、哺乳動物細胞でも、Hela細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に発現ベクターをトランスフェクション後、発現タンパクを抗GFP抗体でウエスタンブロッティング、さらに細胞染色により、その予想される分子量(約70KDa)ならびに細胞内局在を確認できた。
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