| 研究課題/領域番号 |
11877204
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| 研究種目 |
萌芽的研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器外科学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
福島 浩平 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (20271900)
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| 研究分担者 |
舟山 裕士 東北大学, 医学部・附属病院, 講師 (50192315)
内藤 広郎 東北大学, 医学部・附属病院, 講師 (90180223)
佐々木 巌 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60125557)
名倉 宏 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90022821)
大谷 明夫 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (30133987)
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| 研究期間 (年度) |
1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1999年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 上皮細胞 / 抗微生物蛋白 / 分子生物学 |
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| 研究概要 |
1.腸内細菌導入モデル大腸上皮のcDNAライブラリーの確立
IQI無菌マウスに腸内細菌を導入し3日間経過した通常化マウス、同型のICR strainで通常環境下で飼育したSPFマウス、30匹より大腸、小腸上皮細胞を分離、ライブラリーを作成した。当初、subtractive libraryを作成する予定であったが、十分なタイターが得られず通常のcDNAライブラリー作成に変更した。蛋白発現効率の点からNot I-Sal Iアームを用い、λZIPLOXに組み込んだ。形質転換後のタイターは、通常化マウス大腸6.1x102/μl、SPFマウス大腸19x103/μl、小腸2.9x102/μlであった。インサートサイズはし2kb前後で、3x105クローンをライブラリー増幅に用い、増幅後のタイターは6x107/μlであった。
2.Antibacterial proteinのスクリーニング
ファージ(1x104)をプレートに播き、通常の発現スクリーニングに従いIPTGにより蛋白発現させたニトロセルロース膜をLBプレートにのせ、上にソフトアガーに希釈した大腸菌XL-1Blue strainを注ぎ培養した。クーマシーブルーにより染色し、大腸菌増殖抑制効果を有するクローンをスクリーニング中である。
3.今後の方向性
最小限の目標である通常化マウスの大腸上皮細胞よりcDNAライブラリーを作成するという目標は達成した。このライブラリーは、Differential DisplayやcDNA microarrayで拾い上げた未知遺伝子のクローニングに活用される。Antibacterial peptideのスクリーニングについては、この系で大腸菌増殖抑制効果を有するpositive control cloneがないこと、subtract libraryでないことからスクリーニング効率が悪いなどの問題がある。
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