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癌抑制遺伝子の機能は。細胞周期の制御、アポトーシスの誘導、DNA修復機構への関与など、抗癌剤の作用機序と密接に関連している。本研究では、抗癌剤に対する感受性と代表的な癌抑制遺伝子であるRb遺伝子とp53遺伝子の変異の有無との関連性を解析するシステムの構築を、骨肉腫をモデルとして目指した。
1.癌抑制遺伝子欠損骨芽細胞系の樹立:p53(-/-)骨芽細胞は、既に我々が樹立したp53ノックアウトマウス由来の骨芽細胞系であるMMC2を用いた。Rb(-/-)骨芽細胞はRb(-/-)ES細胞を用いてキメラマウスを作成し、そのマウスより骨芽細胞を単離し、耐性マーカーを用いて、Rb(-/-)細胞を選択的に増殖させ、分化形質を指標としてRb(-/-)骨芽細胞を得た。
2.発現誘導ベクターの再構築:オリジナルの発現誘導システムは、テトラサイクリン・トランスアクチベーター(tTA)の発現ベクターにはHygromycinが、tTAにより発現が誘導される標的遺伝子発現ベク夕一にはNeomycinの耐性遺伝子が組み込まれているが、上記の細胞には、既にこれらの耐性遺伝子がゲノムに組み込まれているため、ベクターの再構築を行った。tTA発現ベクターに関しては、Puromycinを、標的遺伝子発現ベクターは、Blasticidinを組み込んだものを作成した。標的遺伝子としては、正常ヒトp53及びRb遺伝子をそれぞれ組み込んだものを作成した。
3.細胞への導入:Rb(-/-)骨芽細胞のtTA発現ベクターを導入し、15個のクローンを単離し、βガラクトシダーゼ遺伝子を用いた一過性の発現誘導能を解析したが、テトラサイクリン添加の有無による発現誘導効果が認められたクローンは得られなかった。現在更に、遺伝子導入効率の改善等の工夫を用いて解析を続けている。
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