| 研究課題/領域番号 |
11878091
|
|---|
| 研究種目 |
萌芽的研究
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
環境影響評価(含放射線生物学)
|
|---|
| 研究機関 | 金沢大学 |
|---|
研究代表者 |
松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
|
|---|
| 研究分担者 |
石垣 靖人 金沢大学, 薬学部, 助手 (20232275)
二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1999
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1999年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
|
|---|
| キーワード | DNA損傷 / モノクローナル抗体 / キャピラリー電気泳動 / ヌクレオチド除去修復 / 紫外線 |
|---|
| 研究概要 |
1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製
当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。
2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発
本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^<TM>488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。
|
