微生物ゲノム情報に基づいた新規代謝機構の解明

• 研究課題/領域番号: 11J03910
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 横大路 裕介 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
• 研究期間 (年度): 2011 – 2012
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2012年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 2011年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
• キーワード: アーキア / 代謝 / アミノ酸代謝 / Glutamatic acid / glutamate dehydrogenase / Thermococcus / glutamic acid

研究概要

本研究ではアーキアの未知の代謝に着目し、ゲノム情報を利用して新規代謝経路の解明に努めてきた。特に超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisの中央代謝の一つであるアミノ酸異化代謝についてより深い理解を目指した。本代謝は3段階の反応で行われる。まず初段階のアミノ基の酸化反応を触媒するamino acid dehydrogenase活性を細胞抽出液を用いて検討したところ、Gluに対する高い活性とAla,Val,Gln,Cys,Thrに対する弱い活性が検出された。
一方ゲノム情報からはglutamate dehydrogenase (GDH)のみ存在が推定されていた。そこでGDH遺伝子を破壊したところ、Thr以外のアミノ酸に対する活性が検出されず、これらがGDHによるものであったことが明らかとなった。さらにアミノ酸のみに依存した生育条件ではGDH破壊株は全く生育せず、GDHが全ての異化代謝されるアミノ酸の初期酸化を担っていることが明らかとなった。またGDH破壊株はpyruvateを添加した培地では通常通り生育した。この時培養液のアミノ酸および対応する有機酸を定量すると、宿主株よりもアミノ酸全体の分解がより進んでいた。つまりpyruvateのような2-オキソ酸が豊富に存在する時、GDHはアミノ酸の異化代謝を全体的に抑える役割を持っていることが明らかとなった。
次にGluの異化代謝の2,3段階目について遺伝学的解析を行った。ゲノム上にそれぞれ5つ存在するホモログ遺伝子のうち、生化学的解析により同定されていた2-oxoglutarate : ferredoxin oxidoreductaseおよびsuccinyl-CoA synthetaseのみがGluの異化代謝に寄与していることを破壊株の生育の観察と培地中のアミノ酸・有機酸の定量により明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] Genetic examination of initial amino acid oxidation and glutamate catabolism in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis (2013)
  • 著者名/発表者名: Yokooji, Y., Sato, T., Fujiwara, S., Imanaka. T., Atomi, H.
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 巻: VOL 195 号: 9 ページ: 1940-1948
  • DOI: 10.1128/jb.01979-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] CoA biosynthesis in archaea (2013)
  • 著者名/発表者名: Atomi, H., Tomita, H., Ishibashi, T., Yokooji, Y., Imanaka, T.
  • 雑誌名: Biochemical Society Transactions 巻: VOL 41 号: 1 ページ: 427-431
  • DOI: 10.1042/bst20120311
  • 査読あり
• [雑誌論文] Programmable plasmid interference by the CRISPR-Cas system in Thermococcus kodakarensis (2013)
  • 著者名/発表者名: Elmore, JR., Yokooji, Y., Sato, T., Olson, S., Glover, CV. 3rd, Graveley, BR., Atomi, H., Terns, RM., Terns MP.
  • 雑誌名: RNA biology 巻: VOL 10(印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biochemical characterization of pantoate kinase, a novel enzyme necessary for coenzyme A biosynthesis in the Archaea (2012)
  • 著者名/発表者名: Tomita, H., Yokooji, Y., Ishibashi, T., Imanaka. T., Atomi. H.
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 巻: VOL 194 号: 19 ページ: 5434-5443
  • DOI: 10.1128/jb.06624-11
  • 査読あり
• [雑誌論文] A detailed biochemical characterization of phosphopantothenate synthetase, a novel enzyme involved in coenzyme A biosynthesis in the Archaea (2012)
  • 著者名/発表者名: Ishtbashi, T., Tomita, H., Yokooji, Y., Morikita, T., Watanabe, B., Hiratake, J., Kishimoto, A., Kita, A., Miki, K., Imanaka
  • 雑誌名: Extremophiles 巻: VOL 16 号: 6 ページ: 819-828
  • DOI: 10.1007/s00792-012-0477-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biochemical and genetic characterization of the three metabolic routes in Thermococcus kodakarensis linking glyceraldehyde 3-phosphate and 3-phosphoglycerate (2011)
  • 著者名/発表者名: Matsubara K, Yokooji Y, Atomi H, Imanaka T
  • 雑誌名: Molecular Microbiology 巻: 81巻5号 号: 5 ページ: 1300-1312
  • DOI: 10.1111/j.1365-2958.2011.07762.x
  • 査読あり