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亜鉛フィンガー融合型組換え酵素による革新的な野生型遺伝子ノックアウト法の開発研究

研究課題

研究課題/領域番号 11J05142
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
研究分野 化学系薬学
研究機関東京医科歯科大学

研究代表者

増田 朱美  東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2011 – 2012
研究課題ステータス 完了 (2012年度)
配分額 *注記
1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2012年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2011年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
キーワードzinc finger / nuclease / telomerase / hTERT promoter / ジンクフィンガー / ヌクレアーゼ / テロメラーゼ / hTERTプロモーター
研究概要

テロメアは細胞増殖に伴い短縮され細胞分裂ができなくなる。しかしがん細胞はテロメラーゼの活性化してテロメアを維持している。テロメラーゼ活性はhTERT promoterの発現と相関していることからhTERT promoter領域を標的としたZFNによる反応を試みた。hTERT promoterのがん細胞における転写活性を測定した。Fireny luciferase reporter plasmidの上流にクローニングしたhTERT promoterを挿入した。
Transfection後48時間の細胞からluciferaseの発光強度を測定したところhTERT promoterの長さの差異が転写活性に影響を及ぼした。hTERT core promoterの上流、下流を標的とした5-fingerを有するZFN遺伝子を作製し、Us7,Us8ペアおよびDs7,Ds8ペアともにin vitroにおける切断を確認した。さらに細胞内における切断反応の評価を行った。HEK293細胞内にreporter plasmidおよびZFN expression plasmidを導入し、reporter plasmidの切断によるluciferase発光強度を比較した。標的配列を含むhTERT promoterを有するpGL3 vectorおよび標的配列を含まないCMV promoterを有するpcDNA vectorの二種類のZFN expression plasmidsを用いた。二種類を比較することでZFN expression plasmid中の標的配列の有無によるdonor plasmidの切断効率と発現効率の相関を検討した。細胞内におけるreporter plasmidの切断反応の評価ではCMV promoterを有するZFN expression plasmidを導入した場合の方がhTERT promoterをZFN expression plasmidを導入した場合よりも切断効率が高いことが明らかとなった。またHEK293細胞へZFN expression plasmidをエレクトロポレーションにより導入し、ゲノム上での切断反応を行ったところ、目的のゲノム上で切断が起こったことをsurveyor nuclease assayおよびシークエンス解析により確認した。hTERT promoterによるがん細胞特異的なZFNの発現および自己切断における発現制御が可能となれば治療に向けた利用が期待される。

報告書

(2件)
  • 2012 実績報告書
  • 2011 実績報告書
  • 研究成果

    (12件)

すべて 2012 2011 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (6件) 図書 (3件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Effects of DNA Binding of Zinc Finger and Linkers for Domain Fusion on Catalytic Activity of Sequence-Specific Chimeric Recombinases Determined by a Facile Fluorescent System2012

    • 著者名/発表者名
      Nomura, W., Masuda, A., Ohba, K., Urabe, A., Ito, N., Ryo, A., Yamamoto, N., Tamamura, H.
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 51 号: 7 ページ: 1510-1517

    • DOI

      10.1021/bi201878x

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 設計型DNA組換え酵素の配列特異的反応に関する定量的解析2012

    • 著者名/発表者名
      増田朱美、野村渉、玉村啓和、
    • 学会等名
      第49回ペプチド討論会
    • 発表場所
      かごしま県民交流センター(鹿児島)
    • 年月日
      2012-11-07
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] ジンクフィンガー融合型酵素によるゲノム編集法の開発2012

    • 著者名/発表者名
      野村渉、増田朱美、卜部亜里沙、玉村啓和
    • 学会等名
      第7回日本ケミカルバイオロジー学会
    • 発表場所
      京都大学(京都)
    • 年月日
      2012-06-08
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] Development of Artificial Recombinase for Genome Editing2011

    • 著者名/発表者名
      Masuda, A., Nomura, W., Ohba, K., Yamamoto, N., Tamamura, H.
    • 学会等名
      第8回AFMC International Medicinal Chemistry Symposium
    • 発表場所
      京王プラザホテル(東京)
    • 年月日
      2011-12-01
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] ジンクフィンガー融合DNA組換え酵素の反応効率の最適化2011

    • 著者名/発表者名
      増田朱美、野村渉、大庭賢二、卜部亜里沙、山本直樹、玉村啓和
    • 学会等名
      第5回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      つくば国際会議場(茨城県)
    • 年月日
      2011-09-13
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] Studies for optimum design of artificial zinc finger recombinases by evaluation of effects of DNA binding affinity and linker components on recombination efficiency2011

    • 著者名/発表者名
      Masuda, A., Nomura, W., Ohba, K, Yamamoto, N., Tamamura, H.
    • 学会等名
      22nd American Peptide Symposium
    • 発表場所
      Sheraton San Diego Hotel & Marina (America)
    • 年月日
      2011-06-26
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] 高い反応効率をもつ亜鉛フィンガー融合型DNA組換え酵素の構築2011

    • 著者名/発表者名
      増田朱美
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第6回年回
    • 発表場所
      東京工業大学大岡山キャンパス(東京都)
    • 年月日
      2011-05-25
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [図書] Studies for Optimum Design of Artificial Zinc Finger Recombinases by Evaluation of Effects of DNA Binding Affinity and Linker Components on Recombination Efficiency2011

    • 著者名/発表者名
      Masuda, A., Nomura, W., Ohba, K., Yamamoto, N., Tamamura, H.
    • 出版者
      Proceedings of the Twenty-Second American Peptide Symposium, Michal Lebl (Eds), American Peptide Society, San Diego
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [図書] Development of Bivalent Ligands for CXCR4 with Rigid Linkers and Application to Detection of Cancer Cells2011

    • 著者名/発表者名
      Nomura, W., Tanaka, T., Masuda, A., Narumi, T., Tamamura, T.
    • 出版者
      Proceedings of the Twenty-Second American Peptide Symposium, Michal Lebl (Eds), American Peptide Society, San Diego
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [図書] ペプチドニュースレター第81号22nd American Peptide Symposiumの参加報告2011

    • 著者名/発表者名
      東佑翼、広瀬久昭、増田朱美
    • 出版者
      日本ペプチド学会
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [備考] 東京医科歯科大学生体材料工学研究所 メディシナルケミストリー分野 「研究業績」

    • URL

      http://www.tmd.ac.jp/i-mde/www/molb/publication/index.html

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [備考] 東京医科歯科大学生体材料工学研究所機能分子部門メディシナルケミストリー分野研究業績

    • URL

      http://www.tmd.ac.jp/i-mde/www/molb/publication/index.html

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書

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公開日: 2011-12-12   更新日: 2024-03-26  

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